Information

Reparation av kloningsvektorskär som smälts med antarktisk fosfatas och ligerad med T4-enzym

Reparation av kloningsvektorskär som smälts med antarktisk fosfatas och ligerad med T4-enzym


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Vektorprodukten som erhålls genom ligering mellan en vektor som tidigare digererats med antarktisk fosfatas saknar 5'-fosfatgrupper. T4-ligas kan ligera det till en insats med komplementära klibbiga ändar som ger 2 fosfatgrupper. Men det finns fortfarande 2 hack i vektorprodukten! Hur repareras dessa normalt?


Spåren repareras inte under förberedelsen. Istället omvandlas vektorn (som är cirkulär, trots skårorna) till värden där den repareras av endogena mekanismer, troligen genom basexcision.


Molekylär bioteknik, 3 kap

De är restriktionsendonukleaser som kan skära DNA-molekyler @ specifika platser som kallas igenkänningsställen. Igenkänningsställena innehåller PALINDROMISKA DNA-SEKVENSER och är mellan 4 till 8 bps långa.

Den viktigaste grunden för rekombinant DNA-teknologi är närvaron av restriktionsendonukleaser. Restriktionsenzymer klyver de stora DNA-molekylerna till mindre och hanterbara fragment. Detta krävs för att manipulera DNA-fragmentet och i genkloningsexperiment. Dessutom är klyvningen av DNA med restriktionsenzymer HÖGST SPECIFIK. Således hjälper restriktionsendonukleaser till att skära DNA-provet på ett reproducerbart sätt.

Plasmiden pCEL1 är en cirkulär dubbelsträngad plasmid och behandlas med restriktionsenzymer ett i taget och i kombinationer. Banden som erhålls i baserade par:

SÅ storleken på plasmiden pCEL1 är 6 kilobaspar eftersom den ger ett enstaka fragment med längden 6,0 kb VID DIGESTION med EcoRI, BamHI och Hindlll. Den har också en enda igenkänningsplats för dessa 3 enzymer. Den har tre platser för HaeII

storlek på plasmid --> 4,361 bp
har två gener som ger resistens mot ampicillin och tetracyklin. de kallas Amp^r- och Tet^r-gener.

Tet^r-genen har unika BamHI-, SaII- och HindII-igenkänningsställen. amp^r-genen har ett unikt PstI-ställe. Det finns en unik EcoRI-gen utanför det kodande DNA:t

den har ett replikationsursprung för replikeringen av DNA som fungerar i E.coli

den bibehålls som en plasmid med högt kopietal inklusive E.coli-cellen.

Mål-DNA:t kombineras nu med plasmid-DNA och ligeras med hjälp av enzymet T4 DNA-ligas och ATP. Detta ger en blandning av rekombinanta plasmider med mål-DNA och icke-rekombinanta plasmider som uppstår på grund av självligering av plasmid-DNA. Dessa plasmider transformeras sedan in i värd-E.coli-cellerna.

Cellerna som innehåller det klonade DNA:t identifieras genom att de TRANSFORMERADE cellerna screenas för de två antibiotikaresistensmarkörerna som finns på plasmiden.

Omedelbart efter transformation inkuberas cellerna i ett abx-fritt medium för att tillåta cellerna att växa och uttrycka abx-resistensgenerna. Cellerna odlas sedan i abx vars resistensgen i plasmiden är intakt.
så som till exempel, om mål-DNA sätts in i BamHI-stället i Tet^r-genen, så odlas cellerna först i ampillcin-innehållande medium (resistensgenen i plasmiden är intakt) Cellerna som inte har transformerats överlever inte i detta medium. De transformerade cellerna med och utan mål-DNA växer på detta medium

Införandet av mål-DNA:t i BamHI-stället stör Tet^r-genen och cellen som innehåller denna plasmid är inte längre resistent mot tetracyklin. Det är bara resistent mot ampicillin. Om plasmiden inte innehåller DNA-insättningen har den en intakt Tet^r-gen och är resistent mot båda antibiotika.

i nästa steg stryks därför cellerna som har växt på ampicillinmedium ut på ett medium med tetracyklin genom att markera de relativa positionerna för kolonierna.
Endast celler som innehåller den intakta Tet^r-genen som är de självligerade plasmiderna växer på detta medium.

storlek --> 2 686 bp
den har en gen som ger resistens mot abx ampicillinet. kallas amp^r-genen.

den innehåller också en region av B-galaktosidasgenen (lacZ) som är en del av laktosoperonet i E.coli. detta är under kontroll av lac-promotorn som kan regleras. lacI-genen är också närvarande och producerar repressorproteinet som hjälper till att reglera lacZ-genen

den har ett replikationsursprung från plasmiden pBR322 för replikering av DNA som fungerar i E.coli.

innehåller ett kort DNA-segment som kallas det multipla kloningsstället eller polylinkern. detta har ett antal unika kloningsplatser som är klustrade tillsammans. till exempel är EcoRI, BamHI, HincII, PstI, SacI etc några av de platser som finns närvarande i det multipla kloningsstället. Detta finns i lacZ-genen och påverkar inte produktionen av enzymet

mål-DNA:t kombineras nu med plasmid-DNA och ligeras med hjälp av enzymet T4 DNA-ligas och ATP

detta ger en blandning av rekombinanta plasmider med mål-DNA och icke-rekombinanta plasmider som uppstår på grund av självligering av plasmid-DNA. dessa plasmider transformeras sedan in i värd-E.coli-cellerna.

värdcellerna ska kunna producera den andra delen av B-galaktosidas som kallas LacZa. detta kombineras med den del av enzymet som produceras av lacZ-genen och bildar ett aktivt enzym.

ett medium innehållande ampicillin, IPTG och X-Gal används för att odla de behandlade värdcellerna. IPTG fungerar som en inducerare av lac-operonet och X-Gal fungerar som ett substrat för B-galaktosidas. vid hydrolys producerar X-Gal en blåfärgad förening. närvaron av ampicillin säkerställer att de icke-transformerade cellerna inte växer på mediet

celler som har transformerats med självligerade plasmider producerar det aktiva B-galaktosidas-enzymet och hydrolyserar X-Gal för att producera blåfärgade kolonier. Celler som har transformerats med den rekombinanta plasmiden kommer inte att producera det aktiva enzymet och producera vitfärgade kolonier. detta beror på att mål-DNA:t som introduceras i det multipla kloningsstället stör lacZ-genen och så DET AKTIVA ENZYMET PRODUCERAS INTE


Reaktionsbuffertar

  • T4 DNA-ligasbuffert (NEB #B0202) ska tinas på bänken eller i handflatan och inte vid 37°C (för att förhindra nedbrytning av ATP).
  • När T4 DNA-ligasbufferten är upptinad ska den placeras på is.
  • Ligeringar kan utföras i vilken som helst av de fyra standardrestriktionsendonukleas-NEBuffarna eller i T4-polynukleotidkinasbuffert (NEB #B0201) om de kompletteras med 1 mM ATP.
  • När du kompletterar med ATP, använd ribo ATP (NEB #P0756). Deoxyribo ATP kommer inte att fungera.
  • Före ligering, inaktivera restriktionsenzym fullständigt genom värmeinaktivering, spinnkolonn (NEB #T1030) eller fenol/EtOH-rening.
  • Värmeinaktivera (Antarctic Phosphatase, Quick CiP, rSAP) före ligering.
  • Håll den totala DNA-koncentrationen mellan 1-10 &mikrog/ml.
  • Vektor: Insatsens molära förhållanden mellan 1:1 och 1:10 är optimala för enstaka insättningar (upp till 1:20 för korta adaptrar). Infoga: vektorns molförhållande bör vara 6:1 för att främja flera insättningar. Använd NEBioCalculator för att beräkna molära förhållanden.
  • För kloning av mer än ett inlägg rekommenderar vi NEBuilder ® HiFi DNA Assembly Products.
  • Om du är osäker på din DNA-koncentration, utför flera ligeringar med olika förhållanden.

Subkloning

Subkloning är processen att flytta insert-DNA från en vektor till en annan genom att förbereda DNA-insättningen och den nya vektorn separat, ligera dem tillsammans och screena kloner av den resulterande blandningen för att identifiera den önskade subklonen.

Subkloning görs eftersom den nya vektorn eller det nya arrangemanget av insatta DNA(n) i den planerade subklonen erbjuder en viss fördel jämfört med den gamla vektorn eller arrangemanget.

Även om det finns lika många potentiella fördelar som det finns vektorer och det finns hundratals om inte tusentals olika vektorer. Det finns dock några vanliga teman. En är att den optimala kloningsvektorn, lambda-fag, inte är optimal för att producera stora mängder DNA lätt för användning i andra syften, såsom fragmentisolering för subkloning. För att lösa detta subklonas DNA som nyligen klonas från ett lambdabibliotek vanligtvis omedelbart in i en plasmidvektor, som erbjuder mycket större utbyten av DNA mycket lättare än lambdafag.

I ett typiskt fall isoleras ett cDNA (komplementärt DNA) för en specifik gen genom att klona en enda rekombinant fag (bakteriellt virus) från ett rekombinant fag-cDNA-bibliotek. Fagen har ett mycket stort DNA-genom och det klonade cDNA representerar bara 2 till 5 % av det. Efter en dags arbete kan man isolera kanske 25 mikrogram fag-DNA, som bara innehåller 0,5 till 1 mikrogram av cDNA. Subkloning av den till en annan subkloningsvektor för allmänt bruk först, helt enkelt för att göra det enkelt att göra mer av det. Från en sådan subkloningsvektorkonstruktion är det lätt att göra flera milligrammängder av cDNA på kort tid.

Ett annat skäl att subklona är att sätta DNA av intresse i ett nytt sammanhang för uttryck som RNA och/eller protein. Typiskt kräver uttryck en promotor och terminator för att starta och stoppa mRNA-syntes och en komponent som behövs för translation: ett ribosombindningsställe och en öppen läsram som börjar med ett startkodon (ATG) och slutar med ett stoppkodon. Vektorerna som är designade för genuttryck ger vanligtvis allt utom den öppna läsramen. Typiska kloningsvektorer (vanligtvis fag) och typiska subkloningsvektorer för allmänna ändamål (plasmider) innehåller inte alla dessa element. Uttryckselementen skiljer sig mycket åt och är inte kompatibla mellan typer av organismer där uttrycket önskas: bakterier, jäst, insektsceller, ryggradsdjursceller, växtceller, så en annan vektor måste användas för varje.

Slutligen, för att få specifika förändringar i DNA, manipuleras det enzymatiskt (helt in vitro - i provröret). Detta kan göras för att producera fusioner av två DNA-bitar, deletioner av en del av DNA:t eller mutationer (förändringar i DNA-sekvensen). Typiskt producerar dessa enzymatiska manipulationer det önskade DNA:t i mycket små och ofta okända och oupptäckbara kvantiteter. För att vara användbar måste det resulterande (önskade) DNA:t subklonas och amplifieras i bakterier.

PCR och dess användning för subkloning

PCR kan användas för att framställa DNA av intresse för ligering in i en subklon eller för andra in vitro-manipulationer såsom DNA-sekvensering eller restriktionskartläggning. Men när den används förberedande på detta sätt kan PCR skapa problem. Ett problem är att PCR producerar en ganska liten mängd DNA, med minskande utbyte när DNA blir längre. PCR fungerar inte alls bra med DNA över 1000 baspar, och de flesta cDNA är större än så. Dessutom introducerar PCR-amplifiering mutationer slumpmässigt med en hastighet av ett per 2 eller 3 kilobaspar, så alla resulterande subkloner (eller DNA-sekvens eller kartläggning) kan göras med början med en komplex blandning av amplifierade DNA. PCR-amplifierat DNA är också kraftigt förorenat av de korta enkelsträngade DNA-primrarna som stör den bearbetning som behövs för att subklona DNA som gjorts med PCR. Sådana primrar måste avlägsnas före all bearbetning, och detta är ett extra steg som inte är trivialt att genomföra utan att förlora en betydande mängd av den önskade PCR-produkten. DNA som gjorts genom PCR-amplifiering, som är linjär, subklonas bäst om dess ändar skärs med ett eller två restriktionsenzymer, men många restriktionsenzymer skär inte PCR-amplifierat DNA väl nära dess ändar om inte betingelserna är speciellt optimerade. För att göra saken värre, till skillnad från inserts klippta från plasmider, kan man inte säga med agarosgelanalys om ändarna av PCR-förstärkt DNA har skurits av restriktionsenzymer, så ett misslyckande att skära visar sig som ett subkloningsfel först efter flera dagars ytterligare ytterligare ansträngning.

Avancerade PCR-metoder möjliggör PCR-medierad ligering av det amplifierade DNA:t in i vektorn genom att använda PCR-primrar som hybridiserar både till sekvensen av intresse och till vektorns DNA. Även om detta kräver längre primers, har kostnaden för syntes av primers sjunkit dramatiskt under de senaste åren så att längre primers är ganska överkomliga. Problemet med lågt utbyte är inte viktigt med dessa metoder eftersom den PCR-medierade infogningen inte kräver användning av DNA-ligas och bakterier kan amplifiera även de försvinnande små mängderna av cirkulär DNA-produkt från denna metod. Det stora återstående problemet är den höga felfrekvensen för högtemperatur-DNA-polymeraser som används i PCR.

Traditionell (excision-ligation) subkloningsmetodologi

Förbereder insatt DNA

"Insert"-DNA:t, som är det DNA som ska sättas in i en ny vektor via subkloning, kan erhållas från en annan plasmid, från fag-DNA, från genomiskt DNA, från cDNA tillverkat av omvänt transkriptas, eller från något av dessa DNA:er som har amplifierats med PCR (polymeraskedjereaktion). Dessutom kan syntetiskt DNA användas som en insert. Se dock avsnittet ovan som beskriver nackdelarna med att bereda DNA för användning för subkloning genom PCR-amplifiering. I den mest traditionella formen av subkloning skärs DNA som ska subklonas ut från en annan DNA-klon eller subklon med användning av restriktionsendonukleas-digestion.

Traditionellt måste det insatta DNA som klippts ut från dess käll-DNA (vanligtvis fag eller plasmid) genom restriktionsklyvning isoleras från de andra bitarna av DNA som härrör från smältreaktionen. Denna separation av DNA-fragmenten görs genom agarosgelelektrofores. DNA-bandet av intresse skärs sedan bokstavligen från gelén med ett rakblad och DNA:t i agarosbiten extraheras med en av en mängd olika metoder. Dessa metoder tar bort fragmenten av agaros som stör det efterföljande ligeringssteget.

För subkloning beror valet av hur man skär ut det insatta DNA:t ur dess tidigare (initiella) DNA-kontext på vilka restriktionsenzymställen som är tillgängliga för det ändamålet och var annars dessa enzymer skär ut det insatta DNA:t och dess initiala vektor. Det är önskvärt att enzymerna som skär ut det insatta DNA:t inte skärs inuti det insatta DNA:t och att lämna ett kort enkelsträngat överhäng som kommer att vara kompatibelt med det överhäng som görs när subkloningsvektor-DNA:t öppnas (se nedan). Om möjligt bör två olika enzymer användas för att skära ut det insatta DNA:t (en i varje ände), eftersom det möjliggör "riktad subkloning" (se nedan). I vissa fall är det kanske inte möjligt att undvika att skära med ett enzym som också skär inuti insatt DNA. I sådana fall utförs en partiell restriktionsdigerering för att producera det önskade DNA-fragmentet. Det görs genom att klippa startvektorn med insert i en reaktion som inte fullföljs så att bara några av DNA-ställena skärs. Eftersom enzymet skär ställena i varje molekyl slumpmässigt, produceras alla möjliga partiella nedbrytningsprodukter, inklusive vissa DNA-fragment som innehåller interna, oklippta restriktionsställen. I vissa fall måste ett "trubbigt" restriktionsenzym användas för att skära en eller båda ändarna av det insatta DNA:t. I dessa fall är subkloning svårare eftersom det inte finns några "klibbiga ändar" (överhäng) för att hjälpa DNA-sammanfogningen med DNA-ligas. Sådana ligeringar, även om de är möjliga, är något mindre effektiva (färre positiva från de resulterande subklonerna) än de med fragment med överhäng i båda ändar. Eftersom ändarna av det preparerade insättnings-DNA:t måste kunna ligeras med de preparerade ändarna av vektor-DNA:t, kan det vara så att även om överhäng kan produceras på var och en, kanske de inte kan genereras med samma enzymer på grund av brist på tillgängliga eller/eller användbara igenkänningssekvenser. I vissa fall kan enzymer med olika igenkänningssekvenser producera kompatibla överhäng (såsom BamHI och BglII eller Ncol och Sall). I annat fall kan överhäng omvandlas till trubbiga ändar genom att trimma eller fylla i den försänkta änden med DNA-polymeras.

Vektor-DNA

Eftersom målet med subkloning är att skapa en ny DNA-konstruktion (vektor + infogning) som innehåller det insatta DNA:t, kommer det insatta DNA-fragmentet att ligeras in i ett ställe på det önskade vektor-DNA:t (vanligtvis en plasmid). För att förbereda vektor-DNA:t för denna ligering måste det skäras (öppnas) vid det ställe där insättningen önskas ligeras. Till skillnad från insatt DNA är partiell digerering vanligtvis inte möjlig med vektorer och insättningsstället måste bestå av ett eller två unika restriktionsenzymställen på lämplig plats på vektorn i förhållande till sekvenser som behövs för uttryck eller annan biologisk funktion (om någon) och i förhållande till varandra. Närvaron eller frånvaron av de lämpliga restriktionsställena i det insatta DNA:t och vektorn begränsar starkt subkloningsprocessen och när dessa begränsningar är alltför begränsande måste avsevärda ansträngningar ofta göras för att kringgå dem. Ibland, när ett specifikt ställe inte finns i det insatta DNA:t, kan det insatta DNA:t subklonas först in i en annan plasmids multipla kloningsställe, sedan kan det skäras ut med de enzymer som behövs för subkloning in i den verkliga målvektorn. Alternativt kan restriktionsenzymställen i en vektor ändras genom att öppna vektorn och ligera in till de öppna syntetiska DNA-"adaptrarna" eller "länkarna" som introducerar ett nytt restriktionsendonukleasställe. Slutligen kan ett restriktionsställe läggas till ett insatt DNA där det inte fanns något tidigare genom att använda platsspecifik mutagenes, en mestadels distinkt metodik.

I praktiken, för framställning av vektor-DNA:t, är det ofta tillräckligt att helt enkelt skära det med ett eller två enzymer som behövs för att öppna subkloningsstället och sedan denaturera eller på annat sätt avlägsna restriktionsenzymerna eftersom de kommer att störa den efterföljande ligeringen. Av flera skäl är det emellertid ofta önskvärt att gelrena det linjäriserade (klippta) vektor-DNA:t genom separation på en agarosgel och isolering av DNA:t från gelén genom att skära ut en bit av agaros som beskrivits ovan för det insatta DNA:t. För linjära DNA-vektorer såsom lambda och derivat, är varje "arm" av vektor-DNA:t isolerad som distinkta DNA-fragment. En anledning är att gelrening av vektor-DNA-fragmentet eller -fragmenten som ska användas i subkloningen är att detta eliminerar behovet av att använda högrenat vektor-DNA (dvs över CsCl-densitetsgradient). För det andra, när det avlägsnas genom gelrening, finns det ingen chans att "påfyllningsfragmentet" (biten av DNA mellan de två restriktionsställena på vektorn) återligeras in i vektorn under subkloningen. För det tredje kanske vektorn inte skärs upp helt, och eventuell kvarvarande oklippt vektor tenderar att störa den efterföljande screeningen av subkloner. Oskuren originalvektor kan vanligtvis enkelt avlägsnas genom gelrening både av linjära vektorer (på grund av storleksskillnaderna) och rening av plasmidvektorer, eftersom cirkulär och superspiral plasmid-DNA migrerar annorlunda i en gel än det linjära DNA-fragmentet. I allmänhet är det alltid bäst att gelrena vektor-DNA:t eftersom det ger mer robusthet (mindre sannolikhet för misslyckande). Eftersom insatt DNA vanligtvis är gelrenat kan vektorn göras samtidigt för praktiskt taget ingen extra arbetskostnad.

Riktad subkloning

I de flesta fall är det viktigt att det insatta DNA:t subklonas så att det är i en korrekt orientering i vektorstället, typiskt för uttryck som RNA och/eller protein. Om vektorn skärs upp med ett enda restriktionsenzym och det insatta DNA:t har samma överhäng på båda ändarna, är det möjligt för det insatta DNA:t att ligeras in i vektorstället i någon av två orienteringar. Om detta görs måste subklonerna screenas inte bara för närvaron i det insatta DNA:t utan också för orienteringen av det insatta i förhållande till vektorn. Sådana "liknande" ligeringar utsätts också för att vektorn återligeras i frånvaro av något insatt DNA, vilket resulterar i en hög "bakgrund" av insättningsnegativa kandidatsubkloner. Båda dessa problem kan elimineras om två olika restriktionsenzymer används för att öppna vektorn och för att preparera det insatta DNA:t. För att detta ska fungera korrekt måste de två enzymerna lämna inkompatibla DNA-"överhäng" så att de inte kommer att ligera med den andra änden. Detta begränsar ligering av insättningen in i vektorn till fall där insättningen är orienterad på önskat sätt. Detta kallas "riktad subkloning". Som alla bra saker introducerar den åtminstone ett nytt problem. Medan man skär ut insertet ur dess tidigare vektor med hjälp av två olika restriktionsenzymer, är det lätt att avgöra från fragmentprep-gelen om digereringen gick till den önskade fullbordningsnivån genom närvaron av det önskade insert-DNA-fragmentet, detsamma är vanligtvis inte sant för dubbelskärning av den nya vektorn. Medan man skär det nya vektor-DNA:t med två enzymer, är platserna vanligtvis så nära varandra (i "multipelkloningssekvensen" eller MCS) att man en gång inte kan säga från en gelseparation om båda enzymerna eller bara en skär vektorn. Om ett av de två enzymerna skär ineffektivt kommer ligeringen att ha en hög bakgrund och ett relativt lågt utbyte av den önskade subklonen. För att göra saken värre, skär många restriktionsenzymer inte bra nära slutet av ett DNA-fragment, så ofta kommer skärning med en att hämma reaktionen av den andra. Dessutom, om ett av de två enzymerna som används är en trubbig ändskärare, är minskningen av effektiviteten av ligeringen så stor att det vanligtvis är bättre att hålla fast vid en "likändad" (enkelt enzymställe) ligering med ett enzym som lämnar ett överhäng och screenar helt enkelt subklonerna för orientering senare.

Minska bakgrunden av ligeringar med liknande ändar genom att ta bort 5'-fosfatet vid ändarna av vektor-DNA:t

Vektor-DNA:t i en "liknande" ligeringstyp av subkloning öppnades genom skärning med ett enda restriktionsenzym. Detta betyder att ändarna av vektor-DNA:t kan återanneal och ligeras utan insatt DNA under ligeringsreaktionen. Detta beror på att ändarna av ett DNA som klippts med ett restriktionsenzym alltid kan återanneal och ligeras samman, vilket i huvudsak reverserar verkan av restriktionsenzymet. Det är inte bara möjligt för vektorn att återligare med sig själv, denna unimolekylära reaktion är faktiskt starkt gynnad framför den bimolekylära reaktionen som involverar en vektormolekyl med en molekyl av insatt DNA. Denna re-ligering av vektorn utan insättning producerar emellertid inte den önskade subklonen, och så är en oönskad bireaktionsprodukt. Denna bireaktion påverkar subkloningsprocessen negativt på två sätt. För det första förbrukar den vektorn så att mindre av den är tillgänglig att hybridisera med och ligeras till insatt DNA. För det andra orsakar det en större bakgrund av insättningsnegativa kolonier i subkloningen, vilket minskar andelen positiva subkloner (effektivitet) och potentiellt ökar antalet subkloner som kommer att behöva screenas för att få den önskade konstruktionen.

Det finns en metod som minskar möjligheten till återligering av vektorn utan något insatt DNA. Denna metod involverar behandling av det klippta vektorns DNA med ett fosfatas som tar bort fosfatet som finns kvar på varje 5'-ände av det klippta DNA:t. Utan ett fosfat på 5'-änden kan 5'- och 3'-ändarna av vektorsträngarna inte ligeras med DNA-ligas (vilket kräver att 5'-änden har ett fosfat på sig). Eftersom ingendera strängen av vektorns DNA kan återligeras med sin andra ände, kan vektorn inte recirkuleras utan insättning. Om insättning är närvarande och hybridiserar med ändarna av vektorn, kan DNA-ligaset ligera en av de två strängarna (den med 5'-änden av insatt DNA och 3'-änden av vektorns DNA), men inte den andra ett. Eftersom insättnings-DNA vanligtvis är mycket lång, finns det mycket DNA-baspar mellan de två enkelsträngsbrotten ("nicks") kvar efter att ligeringen av insättningen med fosfataserad vektor är klar. Så även om DNA:t inte är helt ligerat (båda strängarna har ett avbrott i sig) verkar DNA:t för bakterierna som om det är helt ligerat för att det ska tas upp av bakterierna. Väl inne i cellerna repareras enkelsträngsbrotten genom normala DNA-reparationsprocesser.

Ligering, transformation och plätering för kolonier

Ligeringar kräver endast ett enzym (T4 DNA-ligas), buffert (inklusive magnesium och ATP som behövs) och vektorn och insatta DNA-fragment. Efter att ha inkuberat dessa tillsammans läggs hela blandningen till bakterier, antingen genom att "omvandla" bakterier som gjorts kompetenta genom kemisk behandling eller genom elektroporering (gör hål i bakterierna med en kort elektrisk puls). Dessa bakterier odlas sedan på agarplattor som innehåller ett antibiotikum (vanligtvis ampicillin) som förhindrar tillväxt av bakterier som inte fått något vektor-DNA. Efter inkubation över natten överförs några av de många bakteriekolonierna på plattorna ("subkloner") till individuella flytande kulturer och små mängder (typiskt 3 ml kultur) odlas upp som suspensioner för isolering av plasmid-DNA, som sedan screenas. Vanligtvis behöver endast 5 till 10 subkloner screenas för eventuell ligering. Subkloner kan också screenas omedelbart utan att växa upp dem som små suspensionskulturer genom att använda analytisk PCR. Men PCR-screening detekterar vanligtvis bara närvaron av en del av det insatta DNA:t. (vanligtvis är det för lång tid att upptäcka allt), och kontrollerar inte u om insatsen är intakt. Den kan användas för att screena orienteringen av infogningen (en primer i infogningen och en i vektorn), men detta detekterar inte ovanliga (och visserligen ovanliga) omarrangemang som ibland inträffar under ligeringar, särskilt under subkloningar som sker med låg effektivitet.

Eftersom plasmidisoleringen och screeningen vanligtvis tar ytterligare en dag eller två, är det extremt användbart att undvika att göra detta om ligeringen inte fungerade bra. Sådan tidig varning kräver att någon användbar observation görs vid tidpunkten för uppkomsten av bakteriekolonier på plattorna. Tyvärr är två enkla metoder varken tillförlitliga eller allmänt tillämpliga. En enkel metod är att använda en vektor med en LacZ (beta-galaktosidas) A-kedja som kompletterar en kort version av LacZ i cellerna och katalyserar en reaktion som gör kolonin blå om ett kromogent substrat (X-Gal) ingår i tallrikagaren. Om insatt DNA är närvarande, avbryts LacZ A-kedjesekvensen och en funktionell version av den skapas inte och kolonin blir inte blå. Denna metod för förscreening av kolonier kan inte användas i expressionsvektorer eftersom LacZ-sekvenserna interfererar med expressionen av vektorns cDNA. Det misslyckas också ofta, eftersom bakterierna ofta kommer att återligare (stänga) en öppen vektor utan att inkludera ett insatt DNA men ofta med en liten mutation vid subkloningsstället som hindrar A-kedjan i Lac Z från att fungera (därav vita kolonier utan insatser). Detta är särskilt vanligt med trubbiga inlägg och riktad subkloning, men förekommer ofta även med subkloning med liknande ändar (särskilt om vektorns DNA behandlades med fosfatas).

Den andra enkla metoden för att få tidig varning om en misslyckad ligering är att bara räkna kolonierna av subkloner. Antalet kolonier varierar dock mycket, delvis beroende på variation i bakgrunden och positiva räkningar. Enkla koloniräkningar är dock informativa när de jämförs med de rätta kontrollerna. För att göra detta, samtidigt som en vanlig ligeringsreaktion (som involverar vektor och insatt DNA) görs, görs en andra kontrollligering som innehåller vektor-DNA men inte insatt DNA. Koloniräkningarna från kontrollligeringen kan tjäna som en indikation på bakgrunden. Om ligeringsreaktionen som innehåller insatt DNA resulterar i en signifikant ökning av koloniantal jämfört med den insertfria kontrollreaktionen, så var ligeringen troligen framgångsrik. Om det inte finns någon ökning av antalet kolonier till följd av införandet av det insatta DNA:t i ligeringsreaktionen, är chansen stor att ligeringen misslyckades. Observera att denna tolkning gör det logiska antagandet att vektorn inte kan ligera utan insättning. Detta är ett giltigt antagande för riktad subkloning och för ligeringar med liknande ändar där vektorn har behandlats med fosfatas, men det är inte giltigt med ligeringar med liknande ändar som inte använder fosfatasbehandling av vektor-DNA.

Screening av subkloner

Den isolerade subklonplasmiden DNA screenas vanligtvis genom restriktionsenzymdigestion och agarosgelelektrofores. Vanligtvis (men inte alltid) görs detta med enzymet eller enzymerna som används för att öppna vektorn och förbereda insättningen. För ligeringar med liknande ändar innefattar screeningsprocessen vanligtvis två steg. Först måste screeningen göras för att hitta vilka subkloner som är positiva för närvaron av det insatta DNA:t med användning av enzymet som användes för att förbereda det insatta DNA:t och vektor-DNA för ligeringen. Det andra steget analyserar sedan de som är positiva för insatt DNA för att bestämma infogningsorienteringen i vektorn. Denna "orienteringsscreening" görs vanligtvis med ett eller två enzymer som skär vektorn och det insatta DNA:t asymmetriskt för att skilja de två orienteringarna åt. De två orienteringarna kan förutsägas ge olika framgentmönster från sammandraget, och dessa används för att tilldela orienteringen av infogningen i varje kandidatsubklon. I vissa subkloningar kan den första screeningen och orienteringsscreeningen utföras med en enda screeningdigerering, även om en sådan digerering inte kan göras med samma enzym som användes för att öppna vektorn för ligeringen.


DISKUSSION

I den föreliggande studien har vi visat att integrering av en lång AT-DRS i en icke-bräcklig region kan driva bräcklig platsuttryck. Detta ger ett tydligt bevis för den direkta rollen av AT-DRS för att driva kromosomal bräcklighet. Vi fann vidare att DNA-fragment härrörande från den integrerade AT-DRS har en ökad tendens att bilda stabila sekundära strukturer under enkelsträngat tillstånd, vilket förklarar deras förmåga att störa DNA-replikation som leder till genomisk instabilitet (20). Observationen att en stor andel (~45%) av långa AT-DRS längs det mänskliga genomet finns inom cytogenetiskt definierade instabila kromosomregioner, vilket ytterligare lyfter fram att AT-dinukleotidupprepningar är en nyckelfaktor som predisponerar kromosomregioner för bräcklighet.

Brottfrekvensen för den nyligen genererade FS var signifikant lägre än frekvensen vid den endogena FRA16C, från vilken AT-DRS härleddes. Detta indikerade att andra faktorer bidrar till FRA16C-bräckligheten. Intressant nog finns det i FRA16C, förutom den långa AT-DRS som studerats här, ytterligare tre långa (>400 bp) AT-DRS, som visade sig stoppa replikationsgaffelns progression under replikationsspänningsförhållanden ( 20) och förmodligen bidrar till den högre skörheten i det endogena stället. Dessutom avslöjar replikeringstidsdata (http://www.replicationdomain.com) att den endogena FRA16C-regionen replikerar senare i S-fas i förhållande till HPRT-lokuset, vilket kan ytterligare öka svårigheten att slutföra replikeringen längs denna region innan inträde in i mitos. Det kommer att vara intressant att ytterligare karakterisera den nya genererade ömtåliga platsen genom att studera effekten av AT-DRS på regionens förmåga att slutföra replikeringen under S-fasen. Recent finding showed that fragile regions fail to complete their replication during S-phase and the under-replicated sequences are subjected to repair synthesis during mitosis termed MiDAS ( 34).

The question of whether integration of CFS sequences are sufficient to recapitulate FS-like instability was previously addressed using whole BACs containing FRA3B sequences ( 39). Integration of two adjacent FRA3B BACs, 150 kb each, into a non-fragile ectopic site in human cells was able to confer FS-like instability, implying an inherent instability of these sequences. However, a specific sequence motif responsible for the observed fragility in that study could not be identified. In the present work, however, we showed that a long AT-DRS is able and sufficient to drive the formation of an FS in a non-fragile region in the studied cellular system.

A number of fragile sites are enriched with AT-DRSs that have the potential to form alternative non-B DNA secondary structures ( 10, 21, 29, 40). AT-DRSs >200 bp in length are predicted to readily form secondary structures following unwinding of the DNA double helix during replication ( 10). Under aphidicolin treatment, which leads to uncoupling between the DNA polymerase and the helicase ( 41) longer stretches of ssDNA are exposed, which may enhance the formation of stable secondary structures of the AT-DRSs. Three in vitro studies tested the replication dynamics within plasmids containing different AT-DRSs derived from FRA16D ( 21, 22) and an AT-DRS derived from FRA16B ( 40). In one study ( 21), an ∼500 bp sequence which spans a FRA16D region highly enriched with perfect AT repeats, was shown to stall replication fork progression in yeast in a manner depending on the repeat length. Mfold predictions and gel electrophoresis migration analysis of these fragments suggested that the observed replication perturbation involves secondary structure formation ( 21). This suggestion was recently reinforced by showing that this AT-DRS is targeted by the MUS81 structure-specific endonuclease which cleaves the replication forks stalled at DNA secondary structures along this region ( 42). In another study, cell-free assays showed alleviated polymerase stalling within FRA16D-derived AT-DRSs by the addition of the Werner helicase, implicated in processing of secondary structures arising during replication ( 22). In the third study, a FRA16B-derived AT-rich fragment, cloned into a SV40 replication plasmid, was able to fold into branched secondary structures, promoting polymerase stalling ( 40). The probability to fold into secondary structures was increased when the structure-prone strand served as the lagging strand template ( 40). Recently, using HR reporters it was shown that the Bloom helicase activity and the FANCM fork reversal activity are required for preventing double strand breaks (DSBs) formation along AT-DRSs derived from FRA3B, FRA16C and FRA16D ( 14, 15). In an additional recent study, genome-wide analysis in human cells identified structure forming repeats, including quasi palindromic AT-rich repeats, as principal sites of fork collapse upon ATR inhibition ( 43). All these studies demonstrate that AT-DRSs can perturb the replication progression and generate DSBs. In the current study however, we have directly demonstrated that an AT-DRS that was shown to stall the replication fork progression ( 20) and form highly stable secondary structures (Figure 3B) has the ability to create recurrent chromosomal fragility in a non-fragile region. This provides for the first time a direct evidence for the role of the difficult to replicate AT-DRSs in the mechanism underlying fragile site formation.

DNA DSBs induced by hydroxyurea treatment were recently detected within poly(dA:dT) tracts in the CFSs FRA3B and FRA16D, suggesting that in addition to AT-DRSs, other sequences with potential to form non-B DNA sequences may also contribute to the fragility of CFSs under various stress conditions ( 44).

The landscape of CFS expression differs across cell types. This has been attributed to differences in the availability of replication origins and differences in replication timing programs among cell types ( 6). However, for example, FRA16D and FRA3B that are highly expressed in lymphocytes in which they exhibit a paucity of replication initiation events ( 45), are also expressed in fibroblasts (although to a lesser extent) in which replication initiation events are distributed along the fragility core ( 32, 45, 46). This intrinsic instability suggests that features as AT-DRSs which reside along FRA16D and FRA3B ( 18, 47) predispose these regions to breakage, independently of the tissue specific replication program and together with other key features underlying the fragility along CFSs.

CFSs are preferentially unstable in precancerous lesions and during cancer development [reviewed in ( 9, 48)]. A comprehensive study of the gene pairs involved in all recurrent chromosomal translocations in tumor cells found that over half of breakpoints are mapped to human fragile sites ( 49). Sequences within and flanking three randomly selected pairs of translocations prone genes showed enrichment of AT-DRSs, that were shown to form highly stable secondary structures ( 49). Another study analyzed ∼20 000 translocation breakpoints in cancer genomes and found significant association with potential non-B DNA forming sequences, including AT-DRSs ( 50). AT-DRSs were also found as hot spots for translocations causing genetic syndromes, as in the case of the translocation between chromosomes 11 and 22, t(1122), which underlies the Emanuel syndrome or the supernumerary-der(22)t(1122) syndrome. In most patients the translocation breakpoint is found at the center of the AT-DRS ( 51, 52). All these studies highlight the role of AT-DRSs in genomic instability driving cancer and genetic diseases. In summary, the results presented in the current work highlight the deleterious effect of intrinsic DNA features such as the AT-DRSs in driving recurrent genome instability.


1.4: DNA-modifierande enzymer

  • Bidraget av Michael Blaber
  • Professor (biomedicinska vetenskaper) vid Florida State University

Metylaser

Precis som studien av det bakteriella restriktionsmodifieringssystemet har tillhandahållit en mängd specifika endonukleaser, finns det också en mängd specifika DNA-metylaser tillgängliga.

  • Igenkänningssekvenserna för metylaserna är desamma som de associerade endonukleaserna (t.ex. EcoR1-metylas känner igen och metylerar vid sekvensen "GAATTC").
  • Alla metylaser överför metylgruppen från S-adenosylmetionin (SAM) till en specifik bas i igenkänningssekvensen, och SAM är en nödvändig komponent i metyleringsreaktionen.
  • Metylering av DNA har vanligtvis effekten att skydda DNA från det relaterade restriktionsendonukleaset. Det finns dock metylaser med minimal specificitet. Till exempel, Sss I metylas kommer att metylera cytosinrester i sekvensen 5' &hellip CG &hellip 3'. I detta fall, det metylerade DNA:t kommer att skyddas från en mängd olika restriktionsendonukleaser.
  • Vissa restriktionsendonukleaser skär bara DNA vid deras igenkänningsställen om DNA:t är metylerad (t.ex. Dpnl).
  • Ytterligare andra restriktionsendonukleaser kommer att skära både metylerat och icke-metylerat DNA vid deras igenkänningssekvenser (t.ex. BamHI).

Damm och dcm Metylering

  • Metylaset som kodas av damm gen (dam-metylas) överför en metylgrupp från SAM till N6 position för adeninbasen i sekvensen 5' &hellip GATC &hellip 3'.
  • Metylaset som kodas av dcm gen (dcm metylas) metylerar den interna cytosinbasen, vid C5 position, i sekvenserna 5' &hellip CCAGG &hellip 3' och 5' &hellip CCTGG &hellip 3'.
  • Nästan alla stammar av E coli som vanligtvis används vid kloning har en damm+dcm+ genotyp. Poängen här är inte att vi särskilt vill att vårt DNA ska metyleras, men att vi ska göra en dam-dcm- värd någon måste mutera bakterierna och isolera rätt mutant. Det har tydligen inte gjorts för många bakteriestammar. Förmodligen för att damm och dcm metylering påverkar endast en liten delmängd av potentiella restriktionsendonukleaser

DNA isolerat från dam+dcm+ stammar kommer faktiskt inte att skäras av en blygsam undergrupp av tillgängliga restriktionsendonukleaser:

Igenkänningssekvens Restriktionsenzym GATC Ge mig ATC
TGATCA Bcl I + -
GATC Mbo I + -
ATCGAT Cla I + -
TTCTAGA Xba I + -
TCGA Taq I + -
GAAGA Mbo II + -
GGTGA Hph jag + -

DNA kan behöva framställas från E. coli-stammar som är dam-dcm- för att skäras av dessa enzymer.

DNA-polymeraser

Ett stort antal olika polymeraser har karakteriserats och är kommersiellt tillgängliga. Alla DNA-polymeraser delar två allmänna egenskaper:

  1. De lägger till nukleotider till 3'-OH-änden av en primer
  2. Nukleotidernas ordning i den begynnande polynukleotiden är mall riktad

Figur 1.4.1:DNA-replikation

Förutom 5'->3'-polymerasaktiviteten kan polymeraser innehålla exonukleasaktivitet. Denna exonukleasaktivitet kan fortsätta antingen i 5'->3'-riktningen eller i 3'->5'-riktningen.

  • Exonukleasaktivitet i 3'->5'-riktningen gör att polymeraset kan korrigera ett misstag om det innehåller en felaktig nukleotid (så kallad ").felkorrigeringsaktivitet"). Det kan också långsamt bryta ned 3'-änden av primern.
  • Exonukleasaktivitet i 5'->3'-riktningen kommer att tillåta den att bryta ned vilken annan hybridiserad primer som helst som den kan stöta på. Utan 5'->3' exonukleasaktivitet kan obstruerande primrar eventuellt ersättas fysiskt, beroende på vilket polymeras som används.

Olika polymeraser har olika felfrekvenser för felinkorporering och olika polymerisationshastigheter.

E. coli DNA-polymeras I E. coli DNA-polymeras I - Klenow-fragment T4 DNA-polymeras T7 DNA-polymeras Taq DNA-polymeras M-MuLV omvänt transkriptas
5'->3' exonukleasaktivitet * *
3'->5' exonukleasaktivitet * * * *
Felfrekvens (x10 -6 ) 9 40 <1 15 285
Strandförskjutning *
Värmeinaktivering * * * *

Användning av polymeraser

De olika aktiviteterna hos de olika polymeraserna ger dem en mängd olika tillämpningar. Till exempel kan restriktionsendonukleaser ge fragment av DNA med antingen 3'- eller 5'-nukleotid-"överhäng".

  • I fallet med 5'-överhäng kan 5'->3'-polymerasaktiviteten fylla dessa för att göra trubbiga ändar.
  • I fallet med 3'-överhäng kan 3'->5'-exonukleasaktiviteten som finns närvarande i vissa polymeraser (särskilt T4 DNA-polymeras) "tugga tillbaka" dessa ändar för att också göra DNA-fragment med trubbiga ändar.

Figur 1.4.2:Polymerasaktivitet

"Nick-översättning"

Denna metod används för att erhålla starkt radiomärkta enkelsträngade DNA-fragment, som använder sig av 5'->3' exonukleasaktivitet som finns i vissa polymeraser (E coli DNA-polymeras I, till exempel).

  • I denna metod är en DNA-duplex av intresse "nickad" (dvs en av strängarna skärs se DNAse I).
  • Därefter tillsätts DNA pol I tillsammans med radioaktivt märkta nukleotider. 5'->3' exonukleasaktiviteten tuggar bort 5'-änden vid "nick"-stället och polymerasaktiviteten inkorporerar de radiomärkta nukleotiderna. Den resulterande polynukleotiden kommer att vara starkt radiomärkt och kommer att hybridisera till DNA-sekvensen av intresse.

Figur 1.4.3:Nick-översättning

  • Termostabila polymeraser har förmågan att förbli funktionella vid temperaturintervall där DNA-duplexet faktiskt kommer att "smälta" och separeras. Detta har möjliggjort utvecklingen av " Polymeraskedjereaktion" teknik (PCR), som har haft en djupgående inverkan på modern bioteknik. Vi kommer att diskutera denna metod vid ett senare tillfälle.
  • Införlivandet av dideoxibaser (dvs inga hydroxylgrupper på vare sig 2'- eller 3'-kolet i ribossockret) leder till avslutning av polymerasreaktionen. Detta kommer att diskuteras mer i detalj senare. Denna kedjeavslutning genom inkorporering av dideoxinukleotider är dock grunden för Sanger-metoden för DNA-sekvensering, såväl som terapier för att försöka hämma viral replikation.

Nukleaser

Nukleas BAL-31

  • Detta är en exonukleas (startar vid ändarna och arbetar inåt) som kommer att bryta ned både 3' och 5' ändarna av dubbelsträngat DNA. Det kommer inte att göra inre klyvningar ("nicks"), men det kommer att försämra ändarna av DNA vid befintliga interna "nicks" (som skapar både 3'- och 5'-terminaler).
  • Nedbrytningen av ändarna är inte samordnad, vilket betyder att produkten är det inte 100 % trubbig (även om originalduplexet kan ha varit trubbigt).
  • Sådana "överdragna" ändar kan göras trubbiga genom att fylla i och tugga tillbaka med ett lämpligt polymeras (t.ex. T4 DNA-polymeras). Enhetsdefinitionen för 1 enhet är mängden enzym som krävs för att avlägsna 200 baspar från varje ände av duplex-DNA på 10 minuter vid 30 °C.

Figur 1.4.4:Nukleas BAL-31-aktivitet

Exonukleas III

  • Katalyserar det stegvisa avlägsnandet av nukleotider från 3'-hydroxylterminalerna av duplex-DNA.
  • Enzymet kommer att attackera 3'-hydroxylen vid duplex-DNA med trubbiga ändar, med 5'-överhäng eller med inre "nicks".
  • Eftersom duplex-DNA krävs, enzymet ska inte smälta 3'-änden av duplex-DNA där ändarna är 3'-överhäng.

Figur 1.4.5:Exonukleas III-aktivitet

Mung Bean Nuclease (isolerad från mungböngroddar)

  • A enkelsträngsspecifik DNA- och RNA-endonukleas som kommer att bryta ned enkelsträngsförlängningar från ändarna av DNA och RNA och lämnar trubbiga ändar.
  • Enkelsträngsförlängningarna kan vara antingen 5'- eller 3'-förlängningar - båda tas bort och en trubbig duplex lämnas.

Figur 1.4.6:Mung Bean Nuclease-aktivitet

Deoxiribonukleas I (DNAse I) från bovint bukspottkörtel

  • Detta enzym hydrolyserar duplex eller enkla DNA-strängar företrädesvis vid fosfodiesterbindningarna 5' till pyrimidin nukleotider
  • I närvaro av Mg 2+-jon attackerar DNAse I varje sträng oberoende och producerar hack på ett slumpmässigt sätt (användbart för nick-translation)
  • I närvaro av Mn2+ jon DNAs I klyver båda strängarna av DNA i ungefär samma position (men lämnar "ragged"a ändar)

Ligaser

  • Ligaser katalyserar bildning av en fosfodiesterbindning mellan intilliggande 5'-fosfat och 3'-hydroxylterminaler av nukleotider (potentiellt RNA eller DNA beroende på ligas).
  • På sätt och vis är de motsatsen till restriktionsendonukleaser, men de verkar inte påverkas av den lokala sekvensen, i sig.
  • Ligaser kräver antingen rATP eller NAD+ som en kofaktoroch detta står i kontrast till restriktionsendonukleaser.

Följande är olika typer av ligaser och deras egenskaper.

T4 DNA-ligas

  • Isolerad från bakteriofag T4.
  • Kommer att ligera ändarna av duplex-DNA eller RNA.
  • Detta enzym kommer att förena trubbiga ändar såväl som ändar med kohesiva (komplementära) överhängande ändar (antingen 3' eller 5' komplementära överhäng).
  • Detta enzym kommer också att reparera enkelsträngade hack i duplex-DNA, RNA eller DNA/RNA-duplex. Kräver ATP som en kofaktor.

Taq DNA-ligas

  • Detta ligas kommer att katalysera en fosfodiesterbindning mellan två intilliggande oligonukleotider som är hybridiserade till en komplementär DNA-sträng:

Figur 1.4.7:Taq DNA-ligasaktivitet

  • Ligeringen är effektiv endast om oligonukleotiderna hybridiserar perfekt med mallsträngen.
  • Enzymet är aktivt vid relativt höga temperaturer (45 - 65 °C). Kräver NAD+ som en kofaktor.

T4 RNA-ligas

  • Kommer att katalysera bildandet av en fosfodiesterbindning mellan RNA/RNA-oligonukleotider, RNA/DNA-oligonukleotider eller DNA/DNA-oligonukleotider.
  • Kräver ATP som en kofaktor.
  • Detta enzym kräver ingen mallsträng.

T4 RNA-ligas kan användas för en mängd olika syften, inklusive konstruktion av RNA/DNA-hybridmolekyler.

Figur 1.4.8:T4 RNA-ligasaktivitet

DNA-ligas (E. coli)

  • Kommer att katalysera en fosfodiesterbindning mellan duplex-DNA innehållande sammanhängande ändar.
  • Det kommer inte effektivt ligera trubbiga fragment.
  • Kräver NAD+ som en kofaktor.

Figur 1.4.9:DNA-ligas (E. Coli) aktivitet

T4 polynukleotidkinas

  • Katalyserar överföring och utbyte av en fosfatgrupp från g position av rATP (adeninribostrifosfatnukleotid) till 5'-hydroxylterminalen av dubbelsträngat och enkelsträngat DNA eller RNA, och nukleosid 3'-monofosfater.
  • Enzymet kommer också att ta bort 3'-fosforylgrupper.
  • Oligonukleotider som erhålls från automatiserade syntetiserare saknar en 5'-fosfatgrupp och kan därför inte ligeras till andra polynukleotider.

T4-polynukleotidkinas kan användas för att fosforylera 5'-änden av sådana polynukleotider:

Figur 1.4.10:T4 polynukleotidkinasaktivitet


DISKUSSION

The In-Fusion™ cloning method was originally developed to produce a common entry vector for a multi-vector cloning system based on the cre-lox recombination (Clontech). As shown here and by others ( 18) (and Andrew Farmer: Clontech, personal communication), the enzyme can be used in combination with any 15 bp homology region to enable ligation-independent cloning of PCR products. We have exploited this property, in combination with single and multiple promoter vectors, to produce a simple and versatile system for expression of recombinant proteins. We have incorporated the method into a semi-automated pipeline for both vector construction and expression screening using standard laboratory liquid handling instruments. The pilot experiments in 96-well format showed cloning efficiencies of 89% after two clones per target tested, with 94% achievable with four clones tested, which we would recommend to maximize cloning efficiency. The reason(s) for some PCR products not cloning is not clear although the quality and quantity of the input DNA appears to be important. Over the last 12 months in the OPPF, we have used In-Fusion™ to construct a total of 661 vectors from 703 PCR products, an overall cloning efficiency of 94%. These results compare favourably with data reported by other HTP structural genomics consortia using either the Gateway™ recombinatorial system (e.g. 79% PCR product to expression clone efficiency ( 19, 20)) or ‘classical’ restriction enzyme and ligation-dependent methods (e.g. 87% ( 1)).

Multi-promoter vectors have been used to express recombinant proteins in more than one host in parallel, typically baculovirus-infected insect cells and E coli t.ex. ( 21, 22). Similarly, the pOPINE, pOPINF, pOPINJ or pOPINM vectors based on pTriEx2 (Novagen) described in this study can be used to survey expression in E coli, insect cells, and mammalian cells from a single vector, which can be easily constructed in HTP mode with the associated savings in time and resources. Transient transfection of mammalian cells, notably COS7 and HEK293, is widely used to investigate the expression of eukaryotic proteins and can be readily scaled up for production purposes ( 7, 12, 23, 24). We describe the derivation and use of a secretion vector based on the pOPINF/pTriEx2 vector backbone for the HTP expression of extra-cellular proteins and domains. In addition, the expression from single vector constructs in all three hosts (E coli, HEK293T and Sf9 cells) has been demonstrated for five target proteins. This ability to screen in multiple hosts would enable rapid scale-up in the most appropriate host (determined by small-scale screening) without the necessity for additional rounds of sub-cloning. The transient transfection protocol (HEK293 cells) and co-transfection protocols (Sf9 cells), which make use of a commercial transfection reagents, have both been automated to enable consistent HTP operation for functional/structural proteomic applications. As far as we are aware, this is the first report of such implementations.

In summary, we have addressed the primary characteristics we set for an improved strategy for HTP cloning as follows:

The ability to clone genes-encoding proteins, or domains thereof, in a rapid and reliable parallel or high-throughput (HTP) fashion. Cloning efficiencies of >90% have been achieved in a parallel 96-well plate format using a generic vector in combination with the In-Fusion™ enzyme.

The ability to accurately determine the final constructs without the addition of extraneous/vector or restriction-site-derived amino acids to the expressed protein. A suite of vectors has been described which make use of In-Fusion™ cloning to precisely engineer the expressed sequence, for example, introducing an N-terminal His6 tag and 3C protease cleavage site to enable removal of the tag during purification. The utility of this format has been exemplified (Case study I).

The process must be versatile in terms of insert sequence independence. Three case studies have been described in which eighty-two expression vectors have been produced from a variety of target genes using the vector system (Case studies I, II, III).

The process would preferably be single-step, to give rapid and cost-effective vector construction. Vector construction involves a single-step reaction that enables the simple and rapid construction of vectors in parallel using a 96-well plate format. Further, certain PCR products are compatible with multiple fusion vector formats (e.g. N-His, N-His-GST and N-His-MBP—see examples in Case study III) thereby enabling cost-effective use of PCR primers.

The constructs should be capable of expressing proteins from multiple hosts, i.e. a single vector capable of expression in E coli, mammalian cell lines (e.g. HEK293T cells) and insect cell lines (e.g. Sf9 cells). By adapting a multi-promoter vector a single cloning step has been used to produce a single vector suitable for expression in E. coli, mammalian and insect cells. The utility of this has been exemplified (Case study III).

The expressed proteins must be capable of purification in HTP mode, i.e. they must all be fused to a common affinity purification ‘tag’ which may be removed, if desired, by enzymatic digest prior to crystallization. All vectors, regardless of additional fusion protein expressed, add either an N-terminal or C-terminal His6 tag onto the expressed target protein to facilitate detection and purification. The purification of proteins expressed both intracellularly in E. coli and secreted from mammalian cells using a common purification strategy has been exemplified (Case studies I and II).

The process should be amenable to automation. Laboratory automation to carry out liquid handling tasks involved in the various stages of the expression screening experiments in all three hosts has been described.


Resultat

Cernunnos Promotes Joining of Mismatched Ends and Noncohesive Ends.

We purified Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos to apparent homogeneity (Fig. 1 A) and tested their ability to join cohesive 5′ ends (EcoRI–EcoRI) or cohesive 3′ ends (KpnI–KpnI). To measure joining efficiency, we used quantitative PCR, which amplified junctions produced from one pair of ends. The PCR primers eliminated signals from competing junctions, such as those produced from intramolecular ligation into circular monomers or intermolecular ligation of other ends. Ku, DNA-PKcs, and XL joined EcoRI–EcoRI ends and KpnI–KpnI ends with efficiencies of 1.2–2.2% (Fig. 1 B, rows 1 and 2). However, the addition of Cernunnos had no effect on joining efficiency.

Cernunnos stimulates the joining of mismatched DNA ends. (A) Purification of NHEJ proteins. Coomassie staining after SDS/PAGE shows our purified preparations of Ku, DNA-PKcs (Pk), Cernunnos (C), and XL. (B) Cernunnos stimulates the joining of noncohesive ends by Ku, DNA-PKcs, and XL. Linear DNA substrates were incubated with no protein (dark gray bars), Ku, DNA-PKcs and XL (light gray bars), or Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos (black bars). The orientation of DNA is depicted in the upper left corner. We tested compatible ends (rows 1–3) with cohesive 5′ overhangs (EcoRI–EcoRI), cohesive 3′ overhangs (KpnI–KpnI), or blunt ends (EcoRV–EcoRV). We also tested eight combinations of mismatched ends (rows 4–11). Note that SacII creates a 2-nt 3′ overhang. All other 3′ and 5′ overhangs were 4 nt. We measured joining efficiency by quantitative PCR and expressed efficiency as the percentage of input DNA ends joined (18). Because of large differences among experiments, we plotted joining efficiency on a logarithmic scale. Concentrations of Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos were 5, 5, 0.5, and 2.5 nM, respectively, here and elsewhere unless otherwise noted. (Insets) The overhangs from the KpnI–SacI, Acc65I–EcoRI, and EcoRI–BamHI ends.

Next, we tested whether Cernunnos might affect the joining of noncohesive DNA ends. The addition of Cernunnos to Ku, DNA-PKcs, and XL stimulated the joining of two blunt ends (EcoRV–EcoRV) by 6-fold (Fig. 1 B, row 3). In the absence of Cernunnos, Ku, DNA-PKcs, and XL joined blunt ends paired with either 5′ or 3′ overhangs with low and approximately equal efficiencies (Fig. 1 B, rows 4–7). However, the addition of Cernunnos stimulated joining 30- and 55-fold for the blunt-3′ ends, EcoRV–KpnI and EcoRV–SacII, and 8- and 9-fold for the blunt-5′ ends, EcoRV–EcoRI and EcoRV–BamHI. Thus, Cernunnos had a greater effect on blunt-3′ ends than on blunt-5′ ends.

Cernunnos also stimulated joining of ends with mismatched overhangs by 40- to 150-fold (Fig. 1 B, rows 8–11). Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos joined mismatched 5′ overhangs (Acc65I–EcoRI, 0.0039%) with 23-fold lower efficiency than mismatched 3′ overhangs (KpnI–SacI, 0.091%). However, Cernunnos facilitated more efficient joining when the 5′ overhangs contained partially complementary sequences (BamHI–EcoRI, 0.25%).

In summary, Cernunnos exhibited a preference for 3′ overhangs over 5′ overhangs. This preference also occurred when we omitted DNA-PKcs from the joining reaction [supporting information (SI) Fig. 6]. The effect of Cernunnos appeared to be specific, because Cernunnos had no effect on ligation of blunt ends to 3′ overhangs by bacteriophage T4 DNA ligase (SI Fig. 7).

Cernunnos Requires Ku to Promote Mismatched End Joining by XL.

We were particularly interested in the joining of mismatched 3′ overhangs because they are produced during V(D)J recombination in vivo (15) and because Cernunnos stimulated their joining by 40-fold in vitro (Figur 1 B, row 9). Interestingly, purified XL joined KpnI–SacI ends with low but detectable efficiency, although the addition of Cernunnos failed to stimulate joining by XL alone (Fig. 2 A). However, even a substoichiometric concentration of Cernunnos (0.05 nM) stimulated joining by XL (0.5 nM) in the presence of Ku (5 nM) and DNA-PKcs (5 nM). A stoichiometric excess of Cernunnos (15 nM) stimulated joining 200-fold, up to a level of nearly 1%.

Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos act in concert to join mismatched 3′ overhangs. (A) Cernunnos stimulates the joining of mismatched ends with Ku, DNA-PKcs, and XL but not with XL alone. DNA substrates with mismatched 3′–3′ overhangs (KpnI–SacI) were incubated with XL alone or XL, Ku, and DNA-PKcs (Pk). Concentrations of Ku, DNA-PKcs, and XL were 5, 5, and 0.5 nM, respectively. Cernunnos (C) was added at concentrations of 0.05, 0.1, 0.5, 2.5, 5, and 15 nM. The point in the lower left shows the background PCR signal in the absence of protein. Error bars represent the variation in duplicate measurements. (B) Cernunnos requires Ku to promote mismatched end joining by XL. DNA substrates with mismatched 3′ overhangs (KpnI–SacI) were incubated with different combinations of the core NHEJ proteins Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos (2.5 nM).

To determine which proteins were required for joining mismatched ends, we incubated the DNA with Ku, DNA-PKcs, XL, and Cernunnos in different combinations (Fig. 2 B). As single proteins, only XL produced detectable joining of the KpnI–SacI ends. The addition of Ku and DNA-PKcs to XL increased joining efficiency 12-fold. Starting from the reaction with all four protein preparations, we omitted each protein one at a time. The omission of DNA-PKcs reduced joining only 4-fold, but the omission of Ku or Cernunnos reduced joining 150-fold or 40-fold, respectively. Note that the omission of Cernunnos reduced joining 200-fold when the concentration of Cernunnos was 15 nM rather than 2.5 nM (Fig. 2 A). Significantly, the omission of XL eliminated joining activity completely. Thus, Ku, XL, and Cernunnos were required for efficient joining of mismatched ends. These data suggest that Cernunnos and Ku stimulated a latent joining activity for mismatched ends contained in Ligase IV.

Cernunnos Promotes the Preservation of 3′ Overhangs.

To further characterize the joining of mismatched KpnI–SacI ends, we sequenced the junctions created by Ku, DNA-PKcs, and XL with or without the addition of Cernunnos. Surprisingly, the sequence from one 3′ overhang was retained in every junction, whereas the sequence of the other 3′ overhang was lost (Fig. 3). In the absence of Cernunnos, 21 of the 22 sequenced junctions retained the 3′ KpnI overhang, whereas only 1 junction retained the SacI overhang. This preference occurred only in the absence of Cernunnos and remains unexplained. However, in the presence of Cernunnos, the 3′ overhangs were retained with equal probability.

Cernunnos promotes the retention of overhanging ends. We incubated DNA substrates with Ku, DNA-PKcs, and XL with or without the addition of Cernunnos. The DNA substrates had mismatched 3′–3′ ends (KpnI–SacI), blunt-3′ ends with 4-nt overhangs (EcoRV–KpnI), or blunt-3′ ends with 2-nt overhangs (EcoRV–SacII). We used quantitative PCR to measure the percentage of DNA ends joined and sequenced products from each reaction to characterize the junctions. The key shown at the top indicates how the data are presented for each reaction. The junctions recovered from PCR amplification are depicted to show nucleotide addition (black background) and nucleotide deletion (white background).

We also characterized the joining of blunt ends to 3′ overhangs of 4 nt (EcoRV–KpnI) or 2 nt (EcoRV–SacII). In the absence of Cernunnos, most junctions (20 of 29) lost the 3′ overhang, and only a minority (9 of 29) retained the 3′ overhang (Fig. 3). In the presence of Cernunnos, 62 of 62 sequenced junctions retained the 3′ overhang (Fig. 3). Cernunnos exhibited the same effect when added to Ku and XL in the absence of DNA-PKcs (SI Fig. 8). Thus, the addition of Cernunnos promoted retention of sequences from the 3′ overhangs.

Finally, we characterized the joining of blunt ends to 5′ overhangs (SI Fig. 9). Cernunnos exhibited only a moderate effect in promoting retention of the 5′ overhang for EcoRV–BamHI ends, and no effect on retention of the 5′ overhang for EcoRV–EcoRI ends.

Ku, XL, and Cernunnos Ligate One of the Two Strands from Mismatched DNA Ends.

In an effort to account for the retention or deletion of 3′ overhangs, we examined our purified protein preparations for polymerase or nuclease activities. Polymerase activity was absent because the joining reactions did not include dNTPs and because joining efficiency was unaffected by addition of dNTPs (data not shown). Nuclease activity also was absent because Cernunnos strongly stimulated joining of blunt-3′ ends with retention of 3′ overhanging sequences (Fig. 3 and SI Fig. 8). Furthermore, Cernunnos, Ku, XL, and DNA-PKcs failed to degrade radiolabeled single-strand DNA substrates (SI Fig. 10) and did not delete any nucleotides in 112 junctions from pairs of blunt ends (EcoRV–EcoRV) and cohesive ends (EcoRI–EcoRI and KpnI–KpnI) (SI Fig. 11).

Taken together, our data suggest that Cernunnos and Ku stimulated XL to ligate one of the two strands from mismatched DNA ends. The deletion or retention of 3′ overhangs would depend on which strand was ligated. If Ligase IV catalyzes ligation of only one strand from mismatched ends, the 5′ phosphate group of one DNA substrate should be dispensable for ligation. To test this hypothesis, we removed 5′ phosphates from the DNA substrates with 3′ overhanging KpnI ends or blunt EcoRV ends and incubated the DNA with Ku, XL, and Cernunnos with or without DNA-PKcs (Fig. 4). When we removed the recessed 5′ phosphate on the KpnI end, joining actually increased because of decreased competition from intramolecular circularization of the KpnI substrate. This result demonstrated that the 5′ phosphate on the KpnI end was dispensable for joining. By contrast, when we removed the 5′ phosphate from the blunt EcoRV end, joining decreased to the levels observed when both DNA ends lacked 5′ phosphates. Taken together with the junction sequences (Fig. 3), these data indicated that Cernunnos stimulated the ligation of one strand from each end, joining the overhanging 3′ hydroxyl on the KpnI end to the 5′ phosphate on the blunt EcoRV end.

Ku, XL, and Cernunnos join mismatched ends with the 5′ phosphate from only one end. To determine how Ku, XL, and Cernunnos joined mismatched ends, we treated the EcoRV and KpnI substrates with DNA phosphatase (Antarctic phosphatase New England Biolabs). EcoRV* and KpnI* denote dephosphorylated DNA molecules. We confirmed the successful removal of the 5′ phosphates by incubating each DNA preparation with T4 ligase and were able to demonstrate a loss of >90% of the ligation products by using agarose gel electrophoresis (data not shown). We incubated mismatched DNA substrates (EcoRV–KpnI, EcoRV–KpnI*, EcoRV*–KpnI, or EcoRV*–KpnI*) with Ku, XL (1 nM), and Cernunnos (2 nM), with or without DNA-PKcs amplified the junctions by quantitative PCR and plotted joining efficiency on a linear scale.

We wanted to obtain direct evidence for what we shall refer to as mismatched end (MEnd) DNA ligase activity. To avoid PCR amplification, we designed a gel-based assay with radiolabeled DNA. To unambiguously identify the joined products and improve joining efficiency, we assayed intramolecular joining of linear DNA. Each DNA molecule contained cohesive EcoRI–EcoRI ends, blunt EcoRV–EcoRV ends, or mismatched blunt-3′ EcoRV–KpnI ends (Fig. 5).

Ku, XL, and Cernunnos join mismatched ends by ligation of one strand. (A) Schematic of the gel-based assay for joining. We incubated Ku, XL, and Cernunnos (Ku/XL/C) or T4 ligase (T4) with a linear DNA substrate containing EcoRI–EcoRI, EcoRV–EcoRV, or EcoRV–KpnI ends digested the DNA products with XmnI and used T4 polynucleotide kinase to radiolabel the DNA. Concentrations of XL and Cernunnos were 1 nM and 5 nM, respectively. For EcoRV–EcoRV and EcoRV–KpnI ends, we performed a second digest with ApoI or MspA1I to remove the radiolabel from one DNA strand. To confirm that ligation created a new phosphodiester bond, we digested the products of the EcoRV–EcoRV joining reaction with EcoRV. Radiolabeled DNA strands are red with red asterisks at the 5′ end, and unlabeled DNA strands are black. DNA products were resolved with denaturing gel electrophoresis. (B) Ku, XL, and Cernunnos joined cohesive EcoRI–EcoRI ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) and T4 ligase (lane 4) produced a higher molecular weight band of 498 nt. The molecular weight markers consisted of a radiolabeled 50-bp ladder (lane 1). Joining efficiencies for Ku/XL/C and T4 (calculated from the ratio of intensities in the 498-nt band to the 339-nt band) were 39% and 89%, respectively. Sizes of the ligated higher molecular weight bands in B–D appear in blue typeface. (C) Ku, XL, and Cernunnos joined blunt EcoRV–EcoRV ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) and T4 ligase (lane 4) produced a higher molecular weight band of 470 nt, with joining efficiencies of 20% and 14%, respectively. ApoI digestion converted the 470-nt band to 413-nt and 57-nt bands and converted the 281-nt band to 224-nt and 57-nt bands (lane 6). MspA1I digestion converted the 470-nt band to 434-nt and 36-nt bands and the 189-nt band to 153-nt and 36-nt bands (lane 8). Intensities of the 413-nt and 434-nt bands were reduced to 50% of the 470-nt band because the second digestion removed the radiolabel from one strand. EcoRV digestion eliminated the 470-nt band (lane 10), demonstrating that the DNA junction contained new phosphodiester bonds. The 153-, 57-, and 36-nt bands are not shown. (D) Ku, XL, and Cernunnos joined only one strand from mismatched EcoRV–KpnI ends. Ku, XL, and Cernunnos (lane 3) produced a higher molecular weight band of 472 nt, with a joining efficiency of 5%. ApoI digestion converted the 472-nt band to 415-nt and 57-nt bands and the 281-nt band to 224-nt and 57-nt bands (lane 5). The intensities of the 472-nt and 415-nt bands were equivalent (lanes 3 and 5). MspA1I digestion converted the 472-nt band to a 36-nt band and converted the 191-nt band to a 36-nt band (lane 7), demonstrating the ligation of only one strand.

We incubated the DNA with Ku, XL, and Cernunnos. To detect the joined products by denaturing gel electrophoresis, we cleaved the DNA products with XmnI and labeled the ends with [γ- 32 P]ATP and T4 polynucleotide kinase (Fig. 5 A). This procedure labeled the 5′ ends of DNA strands terminating at XmnI, EcoRI, and EcoRV sites. We measured joining by appearance of a higher molecular weight DNA fragment of the appropriate size. To determine whether joining occurred for a specific strand, we removed the radiolabel on one strand or the other by cleaving the DNA with ApoI or MspA1I.

For the cohesive 5′ overhanging EcoRI–EcoRI ends (Fig. 5 B), Ku, XL, and Cernunnos joined 39% of the input DNA. By contrast, T4 ligase joined 89% of the input DNA. For blunt EcoRV–EcoRV ends (Fig. 5 C), Ku, XL, and Cernunnos joined 20%, and T4 ligase joined 14% of the input DNA. When we removed the radiolabel from one strand by cleaving the DNA with ApoI or MspA1I, 50% of the signal from the higher molecular weight DNA disappeared (Fig. 5 C). Thus, the assay was able to discriminate the joining of one strand vs. the other. The junction formed by joining of the blunt EcoRV ends was susceptible to cleavage by the phosphodiesterase activity of EcoRV, indicating that Cernunnos stimulated a ligation event that created a bona fide phosphodiester bond.

For blunt-3′ EcoRV–KpnI ends, Ku, XL, and Cernunnos joined 5% of the input DNA (Fig. 5 D), which was higher than the result from quantitative PCR of the same DNA products, which detected ligation of 1.6% of the input DNA (data not shown). When we removed the radiolabel from the strand containing the 3′ overhang by MspA1I cleavage, 100% of the signal from the higher molecular weight DNA disappeared. By contrast, removal of the radiolabel from the other strand by ApoI reduced the size of the higher molecular weight fragment by 57 nt without diminishing the signal. This result provided direct evidence for single-strand ligation of the hydroxyl group of the 3′ overhang to the 5′ phosphate of the blunt end. Remarkably, Ku, XL, and Cernunnos ligated blunt-3′ ends with an efficiency of 5%, even in the absence of DNA-PKcs. For comparison, T4 ligase ligated blunt ends with an efficiency of 14%.


Associated Data

Targeted nucleases are powerful tools for mediating genome alteration with high precision. The RNA-guided Cas9 nuclease from the microbial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) adaptive immune system can be used to facilitate efficient genome engineering in eukaryotic cells by simply specifying a 20-nt targeting sequence within its guide RNA. Here we describe a set of tools for Cas9-mediated genome editing via nonhomologous end joining (NHEJ) or homology-directed repair (HDR) in mammalian cells, as well as generation of modified cell lines for downstream functional studies. to minimize off-target cleavage, we further describe a double-nicking strategy using the Cas9 nickase mutant with paired guide RNAs. This protocol provides experimentally derived guidelines for the selection of target sites, evaluation of cleavage efficiency and analysis of off-target activity. Beginning with target design, gene modifications can be achieved within as little as 1𠄲 weeks, and modified clonal cell lines can be derived within 2𠄳 weeks.


Funding for this work was provided by the National Institutes of Health (R01GM121698 to D.A.B, R21AG056706 to D.A.B, R01GM106081 to X.W.) and the Arizona Biomedical Research Commission (ADHS16-162401 to D.A.B). N.B. was supported by a fellowship from the International Foundation for Ethical Research.

Nicholas Brookhouser, Toan Nguyen, Stefan J. Tekel and Kylie Standage-Beier contributed equally to this work.

Tillhörigheter

School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 501 E. Tyler Mall, ECG 334A, Tempe, AZ, 85287, USA

Nicholas Brookhouser, Toan Nguyen, Stefan J. Tekel, Kylie Standage-Beier, Xiao Wang & David A. Brafman

Graduate Program in Clinical Translational Sciences, University of Arizona College of Medicine-Phoenix, Phoenix, AZ, 85004, USA

Molecular and Cellular Biology Graduate Program, Arizona State University, Tempe, AZ, 85287, USA



Kommentarer:

  1. Kagadal

    Hoppsan'

  2. Akigore

    Enligt min mening gör du ett misstag. Jag kan försvara min position. Maila mig på PM, vi kommer att diskutera.

  3. Govind

    Du misstar dig. Låt oss diskutera. Write to me in PM, we will communicate.

  4. Acim

    Det finns naturligtvis små kommentarer ... men i allmänhet är allt sant. Bra blogg, tillagd till favoriter.

  5. Devyn

    På denna fråga, säg att det kan ta lång tid.

  6. Fenririsar

    Jag tror att du tar fel. Jag kan bevisa det. Skriv till mig i PM, vi kommer att diskutera.

  7. Cadda

    Ledsen för att ha stört ... Jag är bekant med den här situationen. Du kan diskutera. Skriv här eller i PM.



Skriv ett meddelande