Information

Om proteiner har en total laddning, hur passerar membranproteiner genom det hydrofoba området av plasmamembranet?

Om proteiner har en total laddning, hur passerar membranproteiner genom det hydrofoba området av plasmamembranet?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Dessa två begrepp verkar nästan motsägelsefulla, proteiner har en negativ nettoladdning på grund av att aminosyrorna i dem var och en har en liten negativ laddning, men ändå kan membranproteiner existera genom att passera plasmamembranet, vilket är ogenomträngligt för laddade molekyler (därav behovet av membranproteiner).

Hur förblir dessa två påståenden sanna samtidigt?


Transmembranproteiner sätts in i membranet i ER i ett ganska komplicerat system, det finns ett helt kapitel om translokation av proteiner i "Molecular Biology of the Cell".

Proteinerna förs genom en vattenhaltig por i Sec61-komplexet, vilket förklarar hur laddade delar av ett protein förs över membranet.

Delarna av ett transmembranprotein som finns kvar i membranet är vanligtvis sammansatta av hydrofoba aminosyror som inte är laddade.

Jag rekommenderar starkt att du läser om hela translokationsgrejen i en cellbiologibok som den Alberts jag länkade till. Det är mycket mer i det än vad jag skrev här.


Membran och transport

Cellmembranet är en grundläggande och definierande egenskap hos celler. Den är sammansatt av ett fosfolipiddubbelskikt, med de hydrofila fosfatgrupperna “head” vända mot den vattenhaltiga miljön på vardera sidan, och de hydrofoba “svansarna” i mitten. De två "broschyrerna", det inre broschyret på den cytoplasmatiska sidan av membranet och det yttre broschyret på den extracellulära sidan, har olika lipidsammansättningar.

Cellmembran innehåller också en ungefär lika stor del, i massa, av integrala membranproteiner, vilket betyder proteiner som är fast inbäddade i det hydrofoba lipiddubbelskiktet. Vissa integrala membranproteiner har alfa-heliska domäner som korsar membranet (transmembrandomäner). Andra proteiner, kallade perifera membranproteiner, är löst och reversibelt associerade med membran, och interagerar med de polära fosfathuvudgrupperna. Cellmembran har även kolhydrater, i form av oligosackarider, kovalent bundna till membranproteiner (glykoproteiner) eller till lipider (glykolipider).

Lipiderna och de integrerade membranproteinerna diffunderar i sidled inom membranets plan, därav “fluid mosaic model” av cellmembran. Men på grund av den hydrofoba inre kärnan korsar fosfolipider och integrerade membranproteiner inte spontant lipiddubbelskiktet eller vänder över det från den ena sidan till den andra.

Membranlipider skiljer sig åt i livets 3 områden

Livets 3 domäner: Bakterier, Archaea och Eukarya, har distinkta membranlipider som utgör utmaningar och ger tips för att rekonstruera livets evolutionära historia på jorden.

Alla celler har fosfolipider (glycerolfosfat med två kolvätekedjor) i sina membran. Bakterier och Eukarya har båda membranfosfolipider med fettsyrakedjor esterkopplade till D-glycerol. Archaea har dock helt olika membranfosfolipider, med grenade isoprenkedjor istället för fettsyror, L-glycerol istället för D-glycerol och eterbindningar istället för esterbindningar (se https://www.ucmp.berkeley.edu/archaea /archaeamm.html och https://en.wikipedia.org/wiki/Archaea). Eterbindningarna och isoprenkedjorna gör Archaeal-membranen mer motståndskraftiga mot värme och extrema pH-värden.

Aktuella hypoteser tyder på att eukaryota celler uppstod från en fusion mellan en arkeal cell och en bakteriecell. Baserat på DNA-sekvenslikheter härstammar eukaryota informationsbearbetningsgener från archaea (Allers och Mevarech 2005, Cotton och McInerney 2010), medan eukaryota membranfosfolipidersyntesgener och energimetabolismgener verkar ha härstammat från bakterier.

Eukaryoter har också membranlipidinnovationer som inte finns i varken Archaea eller Bakterier: steroler och sfingolipider. Steroler (som kolesterol) och sfingolipider (fosfolipider med fettsyrakedjor kopplade till aminosyran serin istället för till glycerol) är huvudkomponenter i eukaryota plasmamembran och kan tillsammans utgöra 50 % av lipiderna i den yttre broschyren (Desmond och Gribaldo, 2009) sfingolipider finns inte i den cytoplasmatiska sidan av plasmamembranets lipiddubbelskikt). Steroler är viktiga i alla eukaryota cellmembran. Steroler minskar membranets fluiditet och permeabilitet och ökar membranets styvhet och styrka. Tillsammans med sfingolipider hjälper de till att organisera regioner av membranet till lipidflottar, mikrodomäner i plasmamembranet med ökad styvhet, som organiserar cellsignaleringsproteiner i funktionella komplex (se recension av Lingwood och Simons, 2010).

Generisk sterolstruktur, från Wikipedia

Kolesterolstruktur, från Wikipedia

Sterolbiosyntes är en komplex väg som kräver molekylärt syre (O2). 11 molekyler syre krävs för att syntetisera bara en molekyl kolesterol (Desmond och Gribaldo, 2009). Därför kunde steroidbiosyntesen inte ha utvecklats före den stora syresättningshändelsen, för cirka 2,4-2,5 miljarder år sedan, när fritt syre först började ackumuleras i jordens hav och atmosfär. Betecknande nog sammanfaller denna gång med ursprunget till eukaryoter i fossilregistret. Utvecklingen av steroidbiosyntesvägar ser alltså ut som en av nycklarna till eukaryoternas utveckling.
För att inte utelämnas har bakterier sina egna speciella membrananpassningar i form av hopanoider, den bakteriella motsvarigheten till membransteroler. Hopanoider har 5 ringar och kräver inte syre för sin biosyntes.

Celler reglerar membranfluiditeten genom att justera membranets lipidsammansättning

Fluiditeten hos ett lipiddubbelskikt varierar med temperaturen. Vid högre temperaturer blir lipiddubbelskikten mer flytande (tänk på att smör smälter en varm dag) och mer genomsläppliga eller läckande. Vid lägre temperaturer blir lipiddubbelskikten stela (som smör i kylskåpet). För att cellmembranen ska fungera korrekt måste de upprätthålla en balans mellan fluiditet, för att tillåta rörelse av proteiner och lipider inuti membranet, tillsammans med membrankrökning, böjning, knoppning och fusion, utan att kompromissa med membranintegriteten och tillåta ämnen att läcka in i eller ut ur membranet. Cellen.
Steroler såsom kolesterol i däggdjur, ergosterol i svampar och fytosteroler i växter, buffertmembranfluiditet och permeabilitet över ett brett temperaturområde. Hos däggdjur ökar kolesterol membranpackningen för att minska membranfluiditeten och permeabiliteten.

De fettsyror svansar av fosfolipider påverkar också membranfluiditeten. Fettsyror kan variera i längd, och antalet dubbelbindningar i kolvätekedjan. Fettsyror utan dubbelbindningar i kolvätekedjan kallas “mättad” eftersom de har det maximala antalet väten. “Omättad” fettsyror, med en eller flera dubbelbindningar, har färre väten (2 färre per dubbelbindning). Naturligt förekommande omättade fettsyror är cis-omättade, vilket betyder att de återstående vätena finns på samma sida av molekylen och resulterar i en böjning i kolvätekedjan. Trans-omättade fettsyror, med väten på motsatta sidor, resulterar fortfarande i en nästan rak kolvätekedja. Trans-omättade fettsyror är sällsynta i naturen, men produceras när vegetabiliska oljor delvis hydreras i livsmedelsförädling.

De olika strukturerna i olika typer av fettsyror påverkar deras kemiska egenskaper och biologiska effekter:

  • längre fettsyror är styvare, minskar membranfluiditeten och permeabiliteten
  • cis-omättade fettsyror ökar membranets fluiditet och permeabilitet genom att störa tät packning av fettsyrasvansar. Cis-fleromättade (2 eller fler dubbelbindningar) fettsyror är ännu mer böjda och störande.
  • organismer anpassar sig till kalla temperaturer genom att öka mängderna av cis-omättade fettsyror för att hålla sina membran flytande.
  • animaliska fetter, som smör, med relativt låga nivåer av cis-omättade fettsyror och höga halter av mättade fettsyror, är fasta vid rumstemperatur
  • vegetabiliska oljor, med höga halter av cis-omättade fettsyror, är flytande vid rumstemperatur

Ett sätt att komma ihåg hur olika lipider påverkar membranets flytbarhet eller styvhet är att lipider som kan packas tätare (som mättade fettsyror och steroler) gör membranen styvare och starkare, men mindre flytande. Allt som stör tät packning av lipider, såsom högre temperaturer eller omättade fettsyror med veck eller böjningar, gör membranen mer flytande.

Membranpermeabilitet och osmos

Lipiddubbelskiktet är “semi-permeabelt, vilket betyder att vissa molekyler kan diffundera snabbt över membranet, medan andra molekyler bara korsar mycket långsamt eller inte alls. I allmänhet kan små oladdade molekyler som O2 och CO2 diffundera över fritt, medan laddade molekyler (Na+, H+) eller polära molekyler (glukos) inte kan. Även vattenmolekyler diffunderar bara långsamt över cellmembranen, eftersom vattenmolekyler är mycket polära.

Osmos är diffusion av lösningsmedel (vatten) molekyler över ett membran. Diffusion resulterar i nettorörelse av molekyler nedför deras koncentrationsgradient, från ett område med hög koncentration till ett område med låg koncentration. Vid osmos rör sig vattenmolekyler från sidan med låg koncentration av lösta ämnen till sidan med högre koncentration av lösta ämnen. Om det finns en skillnad i koncentrationer av lösta ämnen över membranet, kommer molekyler av löst ämne att försöka diffundera över membranet för att utjämna koncentrationerna av lösta ämnen. Men om membranet är ogenomträngligt för de lösta ämnenas molekyler, kommer vatten att röra sig för att försöka utjämna koncentrationerna av lösta ämnen.

Celler är anpassade till sin vattenhaltiga miljö vad gäller deras cytoplasmatiska koncentrationer av lösta ämnen. Däggdjursceller har cytoplasmatiska lösta ämnen som balanserar de fysiologiska saltkoncentrationerna. I fysiologiska saltlösningar finns däggdjursceller i en isotoniska miljö, vilket innebär att koncentrationerna av lösta ämnen inuti cellen och utanför cellen är i balans, så det finns ingen nettorörelse av vatten över cellmembranet. I en hypotonisk lösning är koncentrationen av lösta ämnen utanför cellen lägre än inuti cellen, så vatten kommer in i cellen för att försöka minska den interna koncentrationen av lösta ämnen. I en hypertonisk lösning, koncentrationen av lösta ämnen utanför är högre än inuti cellen, så vatten kommer ut ur cellen och cellen kommer att skrumpna ihop.

Membranproteiner och transport

Hur transporterar celler molekyler som glukos över membranet? Membran har dedikerade transportproteiner med transmembrandomäner. Flera transmembrandomäner samlas för att bilda kanaler i membranet som är specifika för olika molekyler som glukos, fosfat, Na+, H+, Cl- och till och med H2O. Vattentransporten förmedlas av högkonserverade proteiner som kallas akvaporiner, som finns i livets alla tre domäner.

Klicka på länken för att ladda ner och se den molekylära filmen som visar transport av en märkt vattenmolekyl genom en aquaporinkanal. Filmen omfattar cirka 12 nanosekunder:

vattengenomträngning (samma film som i aquaporin-videon ovan)

Molekylernas rörelse genom proteinkanaler kallas underlättad diffusion. Proteinkanalerna är mycket specifika för molekylen och resulterar återigen i nettotransport nedåt en koncentrationsgradient, från en region med hög koncentration till en region med låg koncentration.

Tänk om cellen vill flytta molekyler mot en koncentrationsgradient? Även när fosfatkoncentrationerna utanför cellen är mycket låga kan celler transportera fosfat in i cellen, där den cytoplasmatiska koncentrationen av fosfat kan vara mycket högre. Aktiv transport av molekyler mot deras koncentrationsgradient kräver energiförbrukning, ofta i form av hydrolys av ATP.

Transportkinetik

Aktiv transport är lätt att identifiera eftersom den kräver energi, och transporterar mot koncentrationsgradienten. Men är det möjligt att skilja underlättad diffusion från enkel diffusion?

Eftersom underlättad diffusion medieras av proteinkanaler, och eftersom antalet proteinkanaler i ett cellmembran är begränsat, visar underlättad diffusion mättnadskinetik.

Kinetiken för enkel diffusion och underlättad diffusion. Transporthastigheten (v) plottas mot koncentrationen av löst ämne ([S]) för enkel diffusion av ett löst ämne (visat i rött) och underlättad diffusion av ett löst ämne av ett bärarprotein (visat i grönt). Från https://wikispaces.psu.edu/display/Biol230WFall09/Passive+and+Active+Transport

För att sammanfatta membran och transport, kolla in den här animationen: http://www.johnkyrk.com/cellmembrane.html – ett misstag är att animeringen felaktigt visar sfingolipider på båda sidor (broschyrer) av plasmamembranet, medan sfingolipider är belägen endast på den yttre (extracellulära sidan) broschyren.

För att testa din förståelse för transportprocesser, titta på denna undervisningsbit om cellmembranpermeabilitet.

Lägg samman allt

Bilderna för föreläsningsvideoklippen på denna sida finns i denna fil: B1510_module3_2_membranes_transport_f2012

Citerade verk:
Allers, T, M Mevarech 2005. Arkeal genetik – den tredje vägen, Naturrecensioner Genetics 6: 58-73 doi :10.1038/nrg1504
Cotton, JA, JO McInerney 2010. Eukaryota gener av arkebakteriellt ursprung är viktigare än de fler eubakteriella generna, oavsett funktion, Proc. Natl. Acad Sci. USA publicerades online före tryckning doi: 10.1073/pnas.1000265107
Desmond, E, S Gribaldo 2009. Phylogenomics of sterolsynthesis: insikter i ursprunget, evolutionen och mångfalden av en viktig eukaryotisk egenskap, Genome Biol Evol 1: 364-381 doi: 10.1093/gbe/evp036
Lingwood, D, K Simons 2010. Lipidflottar som membranorganiserande princip, Vetenskap 327: 46-50


Determinanter för membranlipidinhomogenitet

Lipidkolvätekedjor

Lipidkolvätekedjorna kan vara av varierande längd och kan antingen vara mättade eller innehålla en eller flera dubbelbindningar 1 . Vid fysiologiska temperaturer tenderar lipider som innehåller långa och mättade kedjor att existera i gelfas, medan lipider med cis dubbelbindningar på deras svansar föredrar att existera i vätskefasen vid liknande temperaturer 7 . Dessutom verkar hydrofob missanpassning spela en stor roll i den övergripande membranordningen 25 . Till exempel, om ett dubbelskikt som består av en viss kedjelängdslipid är dopat med en liten del av lipider med betydligt kortare eller längre svansar, skulle det skapa lokala områden av störningar på grund av kedjelängdsfelmatchning, och föredrar ett ökat antal klumpig konformationer i acylkedjorna i den regionen. Det är anmärkningsvärt att de flesta av lipiderna som anrikas i "flotten"-domänerna innehåller mättade svansar, inklusive de naturligt förekommande glykosfingolipiderna och sfingomyelin samt fettsyrorna som förankrar proteiner i dessa domäner.

Lipidhuvudgrupper

Lipider innehåller ett stort antal huvudgrupper. Den överlägset vanligaste huvudgruppen i däggdjursceller är fosfatidylkolin, som är zwitterjonisk 1 . Många lipider innehåller även huvudgrupper med en negativ nettoladdning, såsom fosfatidylserin, fosfatidinsyra och fosfatidylglycerol 1 . Mycket nyligen har en sällsynt negativt laddad lipid, lyso-bis-fosfatidinsyra (LBPA), har visat sig koncentreras i de inre involutionerna av sena endosomer 26 . Andra exempel på huvudgruppspecifika interaktioner inkluderar de mellan sfingolipider och kolesterol såväl som mellan glykosfingolipider själva 22 .

Kolesterol

Kolesterol är en väsentlig komponent i däggdjurscellmembran och distribueras inhomogent både mellan olika cellulära membran (t.ex. ~90 % av det cellulära kolesterolet har rapporterats vara lokaliserat till plasmamembranet) såväl som inom samma dubbellager (kolesterolrikt och fattiga domäner) 21 . Det bör dock noteras att de fack som har betecknats som "plasmamembran" från de övervägande biokemiska studierna möjligen inkluderar det endocytiska återvinningsfacket (ERC) och trans-Golgi-nätverket (TGN) utöver det egentliga plasmamembranet, vilket framgår av våra studier med den fluorescerande kolesterolanalogen, dehydroergosterol, såväl som det kolesterolbindande antibiotikumet filipin 27 . Som diskuterats tidigare har kolesterol uttalade effekter på fasbeteendet hos ett lipiddubbelskikt 11 . Dessutom har det rapporterats interagera specifikt med vissa lipidhuvudgrupper (t.ex. sfingomyelin) 28 och transmembranproteiner (t.ex. influensahemagglutinin) 29 . Kolesterol har också en tendens att självassociera i laterala 1- och transbilager 30-dimerer samt att bilda regelbundna hexagonala arrayer 31 .

Membranassocierade proteiner

Många membranassocierade proteiner verkar interagera preferentiellt med en underklass av lipider. Till exempel har flera proteiner rapporterats vara associerade med ett lager av ringformiga lipider 32 . Vidare verkar många transmembranproteiner delas upp i specifika membrandomäner efter aggregering eller tvärbindning av en ligand. Till exempel binder Shiga-toxin till cellytan via en glykosfingolipidreceptor, orsakar aggregering av receptorn till clathrin-belagda gropar och internaliseras effektivt 33 . På liknande sätt internaliseras den GPI-kopplade urokinasreceptorn (uPAR) genom clathrin-belagda gropar på grund av dess interaktion med α2-makroglobulinreceptor eller glykoprotein 330, som båda innehåller godkända clathrin-belagda groplokaliseringssignaler 34 . Företrädesvis uppdelning av vissa proteiner (t.ex. tvärbundna GPI-förankrade proteiner, kinaser från Src-familjen, etc.) i de kolesterol/sfingolipidrika domänerna utgör ett annat exempel på specifika lipid-proteinassociationer 35 .

Membrankrökning

Formerna på alla membranbundna molekyler kan grovt simuleras till en cylinder, en kon eller en inverterad kon 1 . När det gäller lipider är en cylinder en molekyl som har liknande huvudgrupp och svanstvärsnittsareor (t.ex. fosfatidylkolin med mättade eller enskilt omättade svansar). Lysofosfolipider, med större huvudgrupp än svanstvärsnittsareor, utgör inverterade koner medan molekyler som fosfatidinsyra eller fosfatidylserin, med mindre huvudgrupp än svanstvärsnittsareor, utgör lipider med en ungefär konform. Från rent geometriska överväganden är det klart att medan en cylinder skulle passa bekvämt i ett plant dubbelskikt, kommer en konformad och en inverterad konformad molekyl att föredra att bo i membran med motsatta krökningar. Det är anmärkningsvärt att många viktiga cellulära trafficking-händelser (t.ex. vesikulering, tubulation, avklämning av endocytiska vesiklar och sammansmältning av exocytiska vesiklar) åtföljs av skarpa förändringar i membrankrökningen.


K-Ras nanokluster använder digital signalering för att bygga en transmembran analog krets

Insikter i hur Ras nanokluster används för att bygga biologiska kretsar in vivo har kommit från en kombination av beräkningsmodellering och cellbiologiska experiment [13,27]. Dessa studier har visat att MAPK-aktivering är under snäv rumslig reglering. Aktivering av MAPK-modulen sker inte från cytosolen, utan är begränsad till plasmamembranet [13,27]. En nyckelspelare här är Raf-kinashämmarproteinet (RKIP), som blockerar aktivering av MAPK-modulen genom att förhindra all interaktion mellan Raf och MEK [28,29]. RKIP är lokaliserat till cytosolen och fungerar därför som en cytosolspecifik hämmare av MAPK-vägen [27]. På plasmamembranet är MAPK-aktivering ytterligare begränsad till Ras nanokluster, som är de platser till vilka Raf, MEK och ERK ställningar på kinasuppressorn av Ras 1 (KSR1) protein rekryteras och aktiveras selektivt (Figur 1) [13]. En viktig egenskap hos individuella K-Ras nanokluster är att de svarar maximalt på mycket låga "inputs" av Raf-kinasaktivitet [13]. K-Ras nanokluster fungerar därför som signalförstärkare med hög förstärkning, och omvandlar vilken styrka som helst av Raf-kinasingången till en maximal dubbelfosforylerad (ERKpp) utgång (Figur 2). Funktionellt fungerar därför varje nanokluster som en digital lågtröskelomkopplare. För att fånga den spatiotemporala skalan och typen av utsignal från ett individuellt K-Ras nanokluster har de kallats ‘nanoswitches’. Den dominerande parametern inom detta Ras-system är den mycket korta livslängden för ett nanokluster varje nanoswitch finns därför bara kvar ‘on’ för

0,4 s innan demontering [13]. Det andra avgörande systemets beteende är det observerade strikta linjära förhållandet mellan antalet Ras nanoswitchar som genereras på plasmamembranet och koncentrationen av stimulerande epidermal tillväxtfaktor (EGF) (Figur 2) [13]. Som en konsekvens av detta linjära förhållande digitaliserar plasmamembranet den analoga kontinuerliga EGF-ingångssignalen med ett lämpligt, matchat antal nanoswitchar som i sin tur genererar diskreta ERKpp-utgångskvanta [13]. Plasmamembranet som system fungerar därför som en biologisk analog-till-digital-omvandlare (ADC) [27]. I cytosolen summeras de digitala ERKpp-pulserna från alla individuella nanoswitchar för att återskapa en slutlig analog utgång som matchar den ursprungliga analoga EGF-signalen. I huvudsak fungerar cytosolen nu som en enkel digital-till-analog-omvandlare (DAC) [27], och så fungerar hela Ras-systemet som ett analogt digitalt analogt relä (Figur 2).

EGF-signaltransduktion digitaliseras över plasmamembranet. (a) Ras-nanokluster fungerar som högförstärkare som genererar höga eller maximala nivåer av ERKpp-utgång över ett brett spektrum av Raf-kinasingångar. Figuren visar hur utsignalen varierar mot ingången när förstärkarens förstärkning ökar. På den högsta nivån av förstärkning –nivån som Ras-nanokluster fungerar på –, närmar sig nanoklusterutgången en omkopplare med en mycket låg aktiveringströskel. (b) Eftersom Ras-nanokluster fungerar som högförstärkare, genererar de under sin korta existens maximal ERKpp-utgång för att generera en digital burst av ERKpp som släpps ut i cytosolen. På detta sätt fungerar plasmamembranet som en analog-till-digital-omvandlare (ADC), med de digitala skurarna från nanokluster som fungerar som de diskreta kvantala enheterna. (c) Den analoga EGF-ingången som finns i den extracellulära matrisen (ECM) aktiverar EGF-receptorn, vilket utlöser bildandet av flera Ras-nanokluster. Denna bildning, som sker genom en okänd mekanism, är direkt proportionell mot den externa EGF-koncentrationen. (d) När utsignalen från varje nanokluster dumpas i cytoplasman, summeras de digitala pulserna från varje nanokluster för att ge en slutlig cellulär analog ERKpp-utgång. På så sätt vänder cytoplasman den digitala omvandlingen som inträffade vid plasmamembranet och fungerar därmed som en digital-till-analog-omvandlare (DAC). Detta linjära, analoga digitala kretsrelä genererar den robusta, högtrogna signalöverföringen som sker över plasmamembranet in vivo.

Ras nanokluster är avgörande för signaltransduktion. In silico modellering visar att när antalet eller storleken på Ras-nanokluster minskar, misslyckas systemets känslighet för EGF successivt [13]. Om Ras-nanokluster försvinner helt och Ras-proteiner fungerar uteslutande som individuella molekyler, minskar systemets produktion till 3% av den maximala ERKpp-utgången som kan uppnås med intakta nanokluster [13]. Viktigt är att dessa datorsimuleringar exakt matchar biologiska experiment där Ras-signalutgången gradvis förlorades när Ras nanokluster minskade [10]. Ytterligare modellering avslöjar att en avgörande roll för nanokluster är att öka målområdet för membranet som är tillgängligt för rekrytering av Raf och KSR1–MEK𠄾RK. Detta område minskar om Ras-nanokluster successivt minskar, och därmed minskar sannolikheten för framgångsrik rekrytering av komponenterna i MAPK-modulen [13]. Dessa kombinerade data avslöjar att, utan funktionella nanokluster vid plasmamembranet, kan celler inte aktivera MAPK-kaskaden som svar på EGF.


Om proteiner har en total laddning, hur passerar membranproteiner genom det hydrofoba området av plasmamembranet? - Biologi

Generering av membrankrökning är avgörande för bildandet av plasmamembranutsprång och invaginationer och för att forma intracellulära organeller. Bland de centrala regulatorerna av membrandynamik finns BAR-superfamiljens domäner, som deformerar membran till rörformiga strukturer. I motsats till de relativt väl karakteriserade BAR- och F-BAR-domänerna som främjar bildandet av plasmamembraninvaginationer, inducerar I-BAR-domäner plasmamembranutsprång genom en dåligt förstådd mekanism.

Resultat

Vi visar att I-BAR-domäner inducerar stark PI(4,5)P2 klustring vid membranbindning, böj membranet genom elektrostatiska interaktioner och förbli dynamiskt associerade med den inre broschyren av membrantubuli. Således inducerar I-BAR-domäner bildandet av dynamiska membranutsprång i motsatt riktning än vad BAR- och F-BAR-domäner gör. Påfallande nog visade jämförelser av olika I-BAR-domäner att de deformerar PI(4,5)P2-rika membran genom distinkta mekanismer. IRSp53 och IRTKS I-BARs binder membran huvudsakligen genom elektrostatiska interaktioner, medan MIM och ABBA I-BARs dessutom infogar en amfipatisk helix i membrandubbelskiktet, vilket resulterar i större tubulidiameter in vitro och effektivare filopodiabildning in vivo. Vidare visade FRAP-analys att medan däggdjurs-I-BAR-domänerna uppvisar dynamisk association med filopodia, C. elegans I-BAR-domänen bildar relativt stabila strukturer inuti plasmamembranets utsprång.

Slutsatser

Dessa data definierar I-BAR-domänen som en funktionell medlem av BAR-domänens superfamilj och avslöjar mekanismerna genom vilka I-BAR-domäner deformerar membran för att inducera filopodia i celler. Dessutom avslöjar vårt arbete oväntad divergens i mekanismerna genom vilka evolutionärt distinkta grupper av I-BAR-domäner interagerar med PI(4,5)P2-rika membran.


Diskussion

Vi finner att den ökande användningen av positiv laddning som närmar sig protein N-terminaler, sett när man beräknar ett medelvärde över alla proteiner i ett proteom, beror på transmembranproteintopologi i båda E coli och S. cerevisiae (se fig. 6 för illustration). Ett sådant fynd är i enlighet med positiva laddningar som används för att orientera N-svansar i cytosolen i motsats till periplasma. Hypotesen att användning av positiv laddning vid N-terminaler beror på membranproteinorientering gör korrekta förutsägelser om vilka proteiner som har positivt laddade N-terminaler och var i proteiner anrikning av positiv laddning ses. Även om användningen av positiv laddning i genomsnitt ökar när den närmar sig N-terminaler (fig. 1–3), används faktiskt positiv laddning närmare membranets skärningspunkt än den egentliga N-terminalen (fig. 4 och 5). Följaktligen skapas det övergripande ökande genomsnittliga positiva laddningsmönstret vid proteinstarter av längdfördelningen av N-cytosoliska svansar av transmembranproteiner (fig. 5). Att liknande fenomen bidrar till att öka den genomsnittliga positiva laddningen som närmar sig C-terminaler tyder starkt på att N-terminala laddningsmönster helt enkelt är en konsekvens av proteiners strukturella behov, nämligen att orientera sig i membran i enlighet med positiv-insidan-regeln. Dessa N-terminala genomsnittliga positiva laddningsmönster kan helt och hållet rekonstitueras från nedströms positiva laddningsanvändningsmönster nära membran (fig. 7), där inget urval på vare sig rampning eller andra potentiella orsaker till laddningsval som kan vara speciella för N-terminalen, vidare bekräftar den proteinstrukturella grunden för detta positiva laddningsmönster. Viktigt är att vi inte finner något behov av att anropa en translationsramp för att förklara N-terminala positiva laddningstätheter.

Våra resultat utesluter inte att positiva laddningar kan väljas vid ändarna av andra fysiokemiska skäl. Till exempel visar cytoplasmiskt lokaliserade proteiner, även om de inte uppvisar ökande laddning nära N-terminaler, inte heller någon frånvaro av positiv laddning (fig. 2). Det är möjligt att inom en undergrupp av proteiner (antingen transmembrana eller cytosoliska) kan en exponerad svans behöva positiva laddningar för att bland annat binda andra grupper, inklusive negativa laddningar i nukleinsyror (Moarefi et al. 2000), eller den positiva laddningen. kan väljas för de exponerade ändresterna för att förbättra proteinlösligheten (Islam et al. 2012).

Våra resultat ska dessutom inte övertolkas. Vår analys är inte utformad för att fråga om rampen (som observerats i jäst) är verklig eller om rampen är adaptiv. Vi vill helt enkelt veta om ökningen av den genomsnittliga positiva laddningen som närmar sig N-terminaler, som vi har visat vara ett utbrett, om inte fylogenetiskt universellt mönster, bäst förklaras som en del av en mekanism för att stoppa ribosomer. Vi kan inte på grundval av våra resultat dra slutsatsen att det inte finns någon ramp i någon organism eller att någon potentiell ramp nödvändigtvis inte är adaptiv. Vi noterar snarare att laddningen av positiva laddningar vid N-terminaler inte är bevis för att sådan stallning är adaptiv eller att positiva laddningar väljs vid N-terminaler för genregleringsändamål, särskilt som vi finner en mer sparsam förklaring till närvaron av dessa avgifter. I överensstämmelse med att positiv laddning bättre förklaras av en annan faktor än en regulatorisk ramp, finner vi inga bevis för en 5′ ribosomal ramp av de förutsagda dimensionerna (minst 31 kodon) i någon klass av protein vid undersökning av ribosomala fotavtrycksdata i E coli (fig. 8). Detta är ett överraskande resultat eftersom 5′-avvikelser i kodonanvändning (Eyre-Walker och Bulmer 1993), kodad positiv laddning (Berezovsky et al. 1999), mRNA-veckning (McCarthy och Bokelmann 1988 de Smit och van Duin 1990) eller en kombination av de tre förutspåddes orsaka en 5′ ökning av ribosomala tätheter längs ett transkript (Tuller et al. 2011).

Tillsammans med andra nya resultat lägger dock våra resultat lite till litteraturen som ifrågasätter giltigheten av den adaptiva ramphypotesen. Vissa har ifrågasatt, precis som vi, om egenskaperna hos rampen är bättre förklarade i andra termer. Den hypoteserade rampen antas vara, förutom en konsekvens av laddning, orsakad av två andra egenskaper hos 5'-ändar av mRNA: icke-optimal kodonanvändning och stark RNA-veckning (Mitarai et al. 2008 Tuller et al. 2010). Bortsett från problemet att analys av ribosomskyddsdata inte lyckades hitta bevis för att icke-optimala kodon bromsar ribosomer under normala förhållanden (Qian et al. 2012 Charneski och Hurst 2013), finns det en alternativ och mer sparsam tolkning av anrikningen av sällsynta kodon vid 5 ′-ändar, i termer av att minska (inte öka) RNA-veckningsstabilitet för att möjliggöra translationsinitiering (Bentele et al. 2013). I kombination med vår analys verkar slutsatsen att sällsynta kodoner och positiva laddningar är berikade vid 5'-ändar/N-ändar för att möjliggöra ribosomfördröjning nu vara en oförstående modell.

An immediate problem for the ramp hypothesis is our observation that any excess ribosomal occupancy is seen only at the very start of transcripts in E coli. Varför kan detta vara? The ramp is defined as a net increase in mean ribosomal occupancy as one moves toward the 5′-end of transcripts. Recently, it has been suggested that high initiation rates on shorter transcripts will give a higher mean occupancy at 5′-ends when averaged over multiple transcripts of all lengths, but need not necessarily be seen in any given transcript ( Shah et al. 2013). In principle, if initiation rates are not biased toward small transcripts in E coli, such a statistical artifact could explain the apparent species differences ( fig. 8). However, our analysis is normalized by mean transcript occupancy before averaging across genes. As we see on average a downward trend in yeast ( fig. 8), a factor other than, or in addition to, short transcripts undergoing more frequent initiation may be required to explain all of the observed 5′ ribosomal densities in this organism.

A further issue for the ramp hypothesis is whether the high ribosomal occupancy seen in both E coli and yeast in close proximity to the start codon (∼4 codons in E coli, ∼6 in yeast fig. 8) need reflect elongating ribosomes, as the ramp model presumes. In both eukaryotes and prokaryotes, it is possible for small subunits that have not yet bound a large subunit or completed initiation to bind the start site ( Kozak 1999). It may be possible that such noninitiated small subunits are detected by general endonuclease footprinting protocols. Indeed, similar to our results ( fig. 8), other footprinting data sets in E coli ( Oh et al. 2011) and a human embryonic kidney cell line ( Reid and Nicchitta 2012) also profiled short spikes in ribosomal density over only a few codons at the most 5′-ends of transcripts. These short occluded distances at the extreme 5′-end are roughly consistent with the 16–17 nt, which are occluded at the start of the coding sequence by a small subunit at the start codon in yeast ( Anthony and Merrick 1992). We suggest that the differences in elevated average relative ribosomal densities (along the first few codons at least) in all plotted protein subgroups may to some extent simply reflect differences in translation initiation rates.

The above interpretation may be consistent with apparently different results, dependent on method ( Ingolia et al. 2011). For example, addition of the nonhydrolyzable guanosine triphosphate (GTP) analog Guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) prevents full (GTP-dependent) ribosome initiation complex formation, leading to an accumulation of small ribosomal subunits positioned at start codons which occlude about 16–17 nt of the start of the coding sequence ( Anthony and Merrick 1992). The use of an initiation inhibitor in making the E coli data set under consideration ( Li et al. 2012) could then potentially exacerbate the problem of enriched footprints in this region that in fact correspond to nonelongating ribosomes. Additionally, the 5′ charge density may also arise from the fact that GMP-PNP should not have an effect on already-formed initiation complexes that are ready to immediately start translating. Such preformed complexes might be able to translate a couple of codons before the elongation inhibitor chloramphenicol ( Li et al. 2012) or cyclohexamide ( Ingolia et al. 2009) are able to act. Such a mechanism is consistent with the slight upswing in ribosomal density in the 1–2 codons in E coli or 4 codons in S. cerevisiae after the translational start ( fig. 8). It is also consistent with the wider initial ribosomal excess (over ∼6 codons) in yeast compared with E coli, which might result from fewer codons being strictly stalled over the start codon by the initiation inhibitor.

We must emphasize that we do not wish to claim it is necessarily the case that at least some of the increased ribosomal density at 5′ transcript ends is an artifact of the method used to suppress translation, merely that it is a possibility. There might be true taxon-specific differences in initiation or elongation that cause the observed differences in 5′ ribosomal densities in either E coli or yeast, or both. Nor has the potentially confounding issue of ribosomal drop off yet been addressed. Understanding to what extent a 5′ excess of ribosomes is a result of true taxonomic differences versus a methodological and/or statistical artifact must be a high priority. It remains to be discovered whether positive charges have been under selection to modulate ribosome velocity.


Abstrakt

Membrane protein folding and topogenesis are tuned to a given lipid profile since lipids and proteins have co-evolved to follow a set of interdependent rules governing final protein topological organization. Transmembrane domain (TMD) topology is determined via a dynamic process in which topogenic signals in the nascent protein are recognized and interpreted initially by the translocon followed by a given lipid profile in accordance with the Positive Inside Rule. The net zero charged phospholipid phosphatidylethanolamine and other neutral lipids dampen the translocation potential of negatively charged residues in favor of the cytoplasmic retention potential of positively charged residues (Charge Balance Rule). This explains why positively charged residues are more potent topological signals than negatively charged residues. Dynamic changes in orientation of TMDs during or after membrane insertion are attributed to non-sequential cooperative and collective lipid–protein charge interactions as well as long-term interactions within a protein. The proportion of dual topological conformers of a membrane protein varies in a dose responsive manner with changes in the membrane lipid composition not only in vivo but also in vitro and therefore is determined by the membrane lipid composition. Switching between two opposite TMD topologies can occur in either direction in vivo and also in liposomes (designated as fliposomes) independent of any other cellular factors. Such lipid-dependent post-insertional reversibility of TMD orientation indicates a thermodynamically driven process that can occur at any time and in any cell membrane driven by changes in the lipid composition. This dynamic view of protein topological organization influenced by the lipid environment reveals previously unrecognized possibilities for cellular regulation and understanding of disease states resulting from mis-folded proteins. This article is part of a Special Issue entitled: Protein trafficking and secretion in bacteria. Guest Editors: Anastassios Economou and Ross Dalbey.


Results and Discussion

In this study, we performed an ‘acute slice biotinylation assay’ (ASBA) on mouse coronal brain slices (Fig. 1a–d) followed by streptavidin pull-down to separate cell surface-associated proteins in a subfraction termed the ‘PMP enriched fraction’, from the rest of the proteome termed the ‘wash-through fraction’ (Fig. 1e). Traditionally, biotinylation of acute slices and affinity purification is used in combination with immunoblotting to investigate trafficking of receptors and transporters in and out the PM in anatomically or functionally delineated regions of interest in a tissue 16 such as mouse visual cortex in the forebrain 17 . With the intention to verify the applicability of ASBA in combination with proteomic analysis independent of a priori assumptions about the identity of PMPs of potential biological interest and to a lot smaller tissue samples, we also isolated mouse visual cortex tissue (Fig. 1c red), but on mm 3 -scale as study sample.

Workflow for plasma membrane proteomic analysis of small tissue samples.

(a) Dissect organ of interest, like mouse brain, in artificial cerebrospinal fluid (aCSF). (b) Make slices, allow recovery, label with EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin. After quenching, dissect region of interest like the visual cortex (c, red) and mechanically homogenize (d). (e) Separate the plasma membrane protein (PMP) enriched fraction (P) from the rest of the proteome (wash-through, W) by streptavidin pull-down. Panel (f) illustrates SDS-PAGE for P and W. After digestion (g) analyse the protein samples and annotate (h). c adapted from 30 . Scale bar: 1 mm.

To judge the reproducibility of ASBA and streptavidin pull-down, a total protein stain was performed on 1 μg of proteins separated on SDS-PAGE belonging to the PMP enriched fractions and the wash-through fractions (Fig. 1f) derived from 5 different brain samples. The resulting pattern of protein bands, with a predominant location in the higher Mw regions, appeared identical for each of the 5 PMP enriched fractions and differed markedly from the pattern of protein bands, identical between all 5 wash-through fractions. For each of these protein samples we calculated the relative proportion of protein quantity in its PMP enriched fraction to the initial total protein content, that is the sum of the wash-through and PMP enriched fraction. The percentage of proteins in the PMP enriched fraction from each of the extracts ranged between 6.0 and 7.2%.

The clear dissimilarity in band pattern between a PMP enriched fraction and wash-through of one and the same ASBA extract (Fig. 1f), is indicative of a clear difference between the proteins retained on the Streptavidin agarose resin versus those in the eluent. This prompted us to identify the proteins present in the two fractions of each of the 5 brain samples using shotgun proteomics (Table 1 and Supplementary Data 1 and 2). An intermediate step of tube-gel digestion on 25 μg proteins per fraction improved solubilisation and digestion efficiency of membrane proteins 21 and facilitated the removal of detergents prior to mass spectrometric analysis of 1 μg samples (Fig. 1g,h). Next, we used IPA to categorize each identified protein present in the 5 PMP enriched fractions into their subcellular compartment, as an extra validation of the capability of the ASBA method to truly enrich PMPs from a proteomic sample. The percentage of proteins categorised as PMPs by IPA in the 5 separate PMP enriched fractions ranged between 26.8 and 28.8%, illustrating enrichment in and reproducibility of our workflow (Table 1).

For a more detailed analysis of the plasma membrane proteome, we then merged all identifications of the 5 PMP enriched fractions together into 1 protein list. We also merged the identification lists of the 5 wash-through fractions. This resulted in respectively 1,698 and 2,872 discrete proteins that were identified in that PMP enriched fraction and wash-through fraction (Table 1). Of these 1,698 proteins identified in this PMP enriched fraction, IPA successfully annotated 1,625 proteins. Out of these 1,625, 417 proteins or 25.7% were classified as PMP (Table 1 and 2). Because IPA only provides one subcellular localization per protein and does not consider the additional cellular compartments in which a protein can occur 15 , secondary annotations were also checked in IPA and DAVID, in combination with an intensive literature search 6 . As such, a large number of proteins (372) could be additionally assigned to potentially reside in association with (peripheral proteins) or even be fully embedded within the plasma membrane (integral proteins), leading to a total of 789 or 48.6% of PMPs in the PMP enriched fraction (Table 2, Supplementary Table 1, Fig. 1h). Of note, this additional analysis classified an even larger subset of PMPs as ion channel, transmembrane receptor, transporter or G-protein coupled receptor (Table 2 and Supplementary Table 1). Together with these 789 annotated PMPs, another 8 proteins located at the cell surface (0.5%), 163 at the cellular membrane (10.0%) and 51 proteins in the extracellular space (3.1%) (Supplementary Table 2), this accounts for 1,011 or 62.2% proteins in the PMP enriched fraction that have been reported to reside in or near the cell surface (Fig. 1h). The remaining 37.8% proteins in the PMP enriched fraction might be the result of co-purification of large intracellular complexes, with the biotinylated proteins still associated to the plasma membrane or with the readily releasable vesicle pools. These proteins deserve attention in future research to either confirm or exclude their capacity to potentially reside at the PM. In sum, our yields are in agreement with or even higher than recent PMP enrichment studies based on aqueous two-phase affinity partitioning of a much larger tissue sample, a complete rat or mouse cerebellum 13,22 , or on biotinylation and affinity purification of cell surface proteins of cultured mouse cortical neurons 14 .

The efficiency of the presented workflow for the enrichment of PMPs was further validated using the DAVID web tool. This tool allows visualization of the specific protein enrichment in the PMP enriched and wash-through fractions by a gene ontology enrichment analysis on all protein identifications of each fraction relative to a background. The background was built by merging all proteins identified in the PMP enriched with those from the wash-through fraction into one background data set. We used the functional annotation charts of the DAVID web tool based on cellular component ontology and visualized the results in ReViGO treemaps (Supplementary Fig. 1 and 2). The treemap adapted from ReViGO for the PMP enriched fraction (Supplementary Fig. 1) is summarized in Table 3, illustrating an enrichment of proteins associated to the cell surface specific for neuronal cells in the clusters ‘plasma membrane’, ‘plasma membrane part’, ‘ion channel complex’, ‘intrinsic’ and ‘integral component of PM’ and the clusters ‘synapse’, ‘synapse part’, ‘neuron projection’, ‘dendritic spine’ and ‘cell junction’. The treemap adapted from ReViGO resulting from our wash-through data set (Supplementary Fig. 2) summarized in Table 4 shows clusters of proteins associated with different intracellular organelles, especially with mitochondrial function and the ‘respiratory chain’. This reflects the high energy demand and oxygen consumption of neurons and thus the high metabolic rate of the tissue under study 23,24,25,26,27 . Other clusters contain proteins with a role at the envelope, within the endomembrane system and within the membrane-enclosed lumen. Importantly, no clear cluster was suggested for cell surface-associated proteins for the wash-through fraction.

In conclusion, in this report we present the new combination of a procedure for the specific extraction of cell surface-associated proteins including PMPs originating from mm 3 -scale tissue derived from acute tissue slice preparations, with proteomic analysis. This reproducible and efficient enrichment methodology is undoubtedly applicable to many different tissue types and can significantly contribute to future differential plasma membrane proteomics research in many fields of application ranging from neuroscience, cancer and immunology, to stem cell research.


Abstrakt

Protein design is a powerful tool for elucidating mechanisms of function and engineering new therapeutics and nanotechnologies. Although soluble protein design has advanced, membrane protein design remains challenging because of difficulties in modeling the lipid bilayer. In this work, we developed an implicit approach that captures the anisotropic structure, shape of water-filled pores, and nanoscale dimensions of membranes with different lipid compositions. The model improves performance in computational benchmarks against experimental targets, including prediction of protein orientations in the bilayer, ΔΔG calculations, native structure discrimination, and native sequence recovery. When applied to de novo protein design, this approach designs sequences with an amino acid distribution near the native amino acid distribution in membrane proteins, overcoming a critical flaw in previous membrane models that were prone to generating leucine-rich designs. Furthermore, the proteins designed in the new membrane model exhibit native-like features including interfacial aromatic side chains, hydrophobic lengths compatible with bilayer thickness, and polar pores. Our method advances high-resolution membrane protein structure prediction and design toward tackling key biological questions and engineering challenges.



Kommentarer:

  1. Matthieu

    I det är något.Tack för hjälp i denna fråga, desto enklare, desto bättre ...

  2. Dolius

    det mest värdefulla svaret

  3. Eztli

    Jag kommer komma ihåg dig! Jag kommer att räknas med dig!

  4. Altair

    excuse me, i deleted that phrase

  5. Kevinn

    Så det händer. Enter vi kommer att diskutera denna fråga.

  6. Tung

    Jag anser att du inte har rätt. Jag är säker. Skriv till mig i PM så diskuterar vi.

  7. Edwald

    Detta mycket värdefulla budskap



Skriv ett meddelande