Information

Jämföra genuttrycksnivåer mellan kontroll och sjukdom vid olika tidpunkter

Jämföra genuttrycksnivåer mellan kontroll och sjukdom vid olika tidpunkter



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jag har en datamängd med uttrycksnivåer för en lista med gener, uppmätt i replikat vid två olika tidpunkter mellan två grupper; en kontrollgrupp och en sjukdomsgrupp.

Jag vill identifiera förändringarna i uttrycket mellan de två grupperna, men jag har lite problem med att formulera hur man bäst gör detta. Till exempel, om jag har $[C_0]$ och $[C_1]$ som kontrollgrupp mätt till $t=0$ respektive $t=1$, och $[D_0]$ och $[D_1]$ som sjukdomsgrupp hade jag försökt göra:

$$frac{([D_1] - [D_0]) - ([C_1] - [C_0])}{[C_1] - [C_0]}$$

Jag tycker att en veckändring skulle vara lämplig, men det verkar inte vara logiskt logiskt för generna där $[C_0] = [C_1]$ eller $[D_0] = [D_1]$.

Kan någon föreslå ett lämpligt förhållande eller mått? Detta är tillräckligt enkelt när det bara jämförs mellan C och D, (t.ex. hittar du bara $frac{D}{C}$), men jag är inte säker på hur jag ska behandla de olika tidpunkterna.


Genuttrycksprofilen kan ändras vid olika tidpunkter mellan de två grupperna; du bör bestämma vad du faktiskt vill mäta. Om du vill se om den sjuka gruppen skiljer sig från kontrollen bör du jämföra dem vid varje tidpunkt. För de flesta situationer skulle du behöva jämföra bara deras steady state-beteende.

Föreställ dig en sjuk individ som visar vissa fysiologiska skillnader i vissa utvecklingsstadier jämfört med kontrollen men som i slutändan visar sig vara helt normal. Så det som spelar roll i de flesta fall är steady state och inte transienterna.

Men om du är intresserad av förändring i uttryck då ska du jämföra ([D1] - [D0]) med ([C1] - [C0]). Detta kommer att berätta om dynamiken hos de sjuka och kontrollproverna är liknande eller inte.

Det finns problem med veckändringar. Även om de är anständiga mått, kan du inte tillämpa ett t-test med veckförändringar (normalisering till 1 är en annan sak).

Du kan göra ytterligare ett t-test mellan [C1] och [C0] (på samma sätt för D). Detta skulle berätta om den sjuka eller kontrollpopulationen ändrar sitt uttryck vid tidpunkten t=1 eller inte.

AFAIK kan du inte jämföra dynamiken och värdena samtidigt. Vad du ska testa beror på vad du är intresserad av.


En cirkadisk genuttrycksatlas hos däggdjur: konsekvenser för biologi och medicin

Vi genererade högupplösta multiorganexpressionsdata som visar att nästan hälften av alla gener i musgenomet svänger med dygnsrytm någonstans i kroppen. Sådana utbredda transkriptionsoscillationer har inte tidigare rapporterats hos däggdjur. Genom att tillämpa väganalys observerade vi nya klockmedierade spatiotemporala relationer. Dessutom hittade vi en majoritet av de mest sålda läkemedlen i USA riktade mot dygnsgenprodukter. Många av dessa läkemedel har relativt korta halveringstider, och våra data förutspår vilka som kan dra nytta av tidsinställd dosering.


Material och metoder

Behandling av fisk och provtagning

Att undersöka effekten av temperatur på genuttryck i Austrofundulus limnaeus Myers, vi exponerade fiskar för fyra laboratorietemperaturacklimatiseringsregimer (Fig. 1B): konstanta temperaturer på 20°, 26° eller 37°C eller en daglig cyklisk temperaturregim från 20–37°C. Den fluktuerande temperaturregimen utformades för att efterlikna de naturliga temperaturvariationer som upplevs dagligen av A. limnaeus(Podrabsky et al., 1998 Fig. lA). Vuxna hanfiskar med en medelstorlek på 2,1±1,1 g (medelvärde ± s.d.) användes i denna studie för att undvika komplikationer associerade med storlek och könsspecifikt genuttryck. Totalt provtogs 432 fiskar under tidsförloppsprovtagningsregimen. Fisk som användes i detta experiment producerades från ett laboratoriebestånd som har hållits i flera generationer vid 26–28°C. Fisken för varje acklimatiseringsregimen hölls i 210 l glasakvarier. Fisk matades dagligen under experimentets varaktighet kl. 09:00 med frusna blodmaskar (kironomida larver). Experimentet startade (t=0) vid 12:30 h. Fisk togs (fig. 1B-symboler) var 24:e timme för 20° och 37°C acklimatiseringar och var 4:e timme under fluktuerande (20–37°C) och kontroll (26°C) behandlingar. Fyra fiskar avlägsnades från acklimatiseringstanken vid varje tidpunkt och snabbfrystes i flytande kväve. Fisk förvarades vid -80°C i 2-4 veckor före extraktion av totalt RNA från levervävnad.

Naturliga temperaturer och laboratorietemperaturer som upplevs av vuxna Austrofundulus limnaeus. (A) Temperaturrekord under 5 dagar i följd i en typisk tillfällig damm som bebos av A. limnaeus(Podrabsky et al., 1998). (B) Vuxna hanfiskar exponerades för fyra olika termiska acklimatiseringar. För behandling med cykeltemperatur (20–37°C) (svart lina) samlades fisk (öppna cirklar) var 4:e timme under de tre första dagliga cyklerna och sedan igen var 4:e timme på dag 5 och dag 14. Kontrollfisk (grå lina) ) som hölls vid 26°C samlades in (öppna rutor) var 4:e timme på dag 1 och dag 14. Fisk exponerad för konstant 20°C (blå linje) samlades in (öppna blå diamanter) vid 24, 48,72, 96, 168 och 336 h. Fisk exponerad för konstant 37 ° C (rosa linje) samlades in (öppna rosa rutor) som 20 ° C fisk, med undantag för 336 timmars tidpunkt. Tid 0 för temperaturcyklingen är 12:30 h vid en temperatur på 26°C. Notera den brutna axeln i B. Medan fem temperaturcykler togs under den 2 veckor långa acklimatiseringen, cyklade temperaturen kontinuerligt.

Naturliga temperaturer och laboratorietemperaturer som upplevs av vuxna Austrofundulus limnaeus. (A) Temperaturrekord under 5 dagar i följd i en typisk tillfällig damm som bebos av A. limnaeus(Podrabsky et al., 1998). (B) Vuxna hanfiskar exponerades för fyra olika termiska acklimatiseringar. För behandling med cykeltemperatur (20–37°C) (svart lina) samlades fisk (öppna cirklar) var 4:e timme under de tre första dagliga cyklerna och sedan igen var 4:e timme på dag 5 och dag 14. Kontrollfisk (grå lina) ) som hölls vid 26°C samlades in (öppna rutor) var 4:e timme på dag 1 och dag 14. Fisk exponerad för konstant 20°C (blå linje) samlades in (öppna blå diamanter) vid 24, 48,72, 96, 168 och 336 h. Fisk exponerad för konstant 37 ° C (rosa linje) samlades in (öppna rosa rutor) som 20 ° C fisk, med undantag för 336 timmars tidpunkt. Tid 0 för temperaturcyklingen är 12:30 h vid en temperatur på 26°C. Notera den brutna axeln i B. Medan fem temperaturcykler togs under den 2 veckor långa acklimatiseringen, cyklade temperaturen kontinuerligt.

Framställning av cDNA-bibliotek

Lever dissekerades från fryst fisk och totalt RNA extraherades med hjälp av Trizol enligt tillverkarens instruktioner (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Totalt RNA från levern på fyra fiskar poolades för varje tidpunkt. Dessa sammanslagna prover av totalt RNA användes för att framställa cDNA för produktion av mikroarrayen och för att profilera förändringar i genuttryck under temperaturacklimatisering.

Ett cDNA-bibliotek framställdes från totalt RNA poolat från alla fiskar som provades under acklimatiseringarna. SMART cDNA-teknologi (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) användes för att framställa cDNA:t före kloning in i pλTriplEx2 riktad kloningsplasmidvektor (ClonTech). Kortfattat användes totalt RNA som en mall för att skapa en cDNA-kopia av varje mRNA med användning av omvänt transkriptas (Powerscript, ClonTech). Det enkelsträngade cDNA:t amplifierades sedan via långdistanspolymeraskedjereaktion (LD-PCR Cheng et al., 1994). Det amplifierade cDNA:t ligerades sedan in i kloningsvektorn. Behörig E coli (DH10B-celler, Invitrogen) transformerades sedan med de ligerade plasmiderna via elektroporering. Transformerade celler selekterades sedan för närvaro av en cDNA-insättning och ampicillin (100 μg l -1) resistens via blå/vit screening på LB/agarplattor (Sambrook et al., 1989). Totalt 4992 cDNA-kloner isolerades i mikrotiterplattor med 384 brunnar och odlades över natten i LB-medium (Sambrook et al., 1989) kompletterat med 10 % glycerol. Dessa plattor replikerades och förvarades vid -80°C.

Konstruktion av cDNA-mikroarrayen

cDNA-insättningarna från varje isolerad klon i cDNA-biblioteket amplifierades med användning av polymeraskedjereaktion (PCR). En PCR-mastermix bereddes innehållande 1 x Taq. Polymerasbuffert (Promega, Madison, WI, USA), 0,2 mmol l –1 dNTPs och 0,2 μmol l –1 plasmidspecifika primers. En enda reaktionsvolym var 25 μl. PCR-mastermix inokulerades med en liten mängd av en enda bakteriebuljongkultur från 384-brunnars plattan med användning av ett 96-brunnars plattreplikatorverktyg (Nalgene/Nunc, Rochester, NY, USA). Reaktionerna upphettades sedan till 95°C under 2 minuter för att lysera bakterierna och frigöra plasmid-DNA som mall för reaktionen. Reaktioner exponerades sedan för 40 cykler av amplifiering med ett denatureringssteg på 95°C under 0,25 min, ett hybridiseringssteg på 56°C under 0,5 min och ett förlängningssteg på 72°C under 2,5 min. En rad reaktioner från varje platta med 96 brunnar kontrollerades slumpmässigt via agaroselektrofores för att säkerställa korrekt amplifiering av DNA:t.

En liten mängd (7 μl) av det PCR-amplifierade DNA:t överfördes sedan till en 384-brunnars PCR-platta motsvarande den ursprungliga klonplatsen som användes för att se ut reaktionen. Saltkoncentrationen av PCR-reaktionerna bringades till en koncentration av 3× SSC (1× SSC innehåller 150 mmol l –1 NaCl, 15 mmol l –1 natriumcitrat, pH 7,0) genom att tillsätta 20× SSC direkt till PCR-produkterna. Mikroarrayer trycktes på objektglas belagda med poly-l-lysin enligt standardprotokoll (www.microarray.orgspecifika protokoll finns också tillgängliga på killifish.pdx.edu/protocols.htm). Poly-l-lysinbelagda objektglas tillverkades med hjälp av Fisher Scientific (Hampton, NH, USA) Gold Seal-mikroskopobjektglas och Sigma Chemicals poly-l-lysinlösning (se ovanstående webbplatser). Objektglasen förvarades sedan i en exsickator i 3 veckor för att tillåta poly-l-lysinbeläggningen att åldras ordentligt. Mikroarrayer skrevs ut med hjälp av en hemmagjord robot med en 16-stiftskonfiguration (TeleChem Chip Maker II-stift, Telechem ArrayIt, Sunnyvale, CA, USA) och utskrift av ett 18×18 punktrutmönster med ett avstånd på 240 μm mellan fläckarna för varje stift. Denna konfiguration av stift och saltkoncentration i DNA-proverna resulterade i en typisk fläckstorlek runt 140–150 μm. Mikroarrayer efterbehandlades enligt standardprocedurer (se ovan webbplatser).

Profilering av förändringar i genuttryck med hjälp av cDNA-mikroarrayen

Fluorescensmärkta cDNA-sonder framställdes från poly(A)+-berikade RNA-prover. poly(A)+-RNA-prover framställdes från totala RNA-prover med användning av en oligo-dT-cellulosakolonn. Alla poly(A) + RNA-prover är en pool av lika mängder RNA från 4 individer som samlats in vid varje tidpunkt. 1 μg av poly(A) + RNA användes som mall för att göra en enda cDNA-kopia av mRNA-poolen med användning av omvänt transkriptas (RT) och förankrad oligo-dT15och pdN6 slumpmässiga hexamerprimrar i närvaro av amino-allyl dUTP (se ovan webbplatser). RNA-mallen avlägsnades från de avslutade RT-reaktionerna genom att inkubera vid 65°C i 30 minuter i 0,2 moll -1 NaOH och 0,1 moll -1 EDTA. Det enkelsträngade cDNA:t kopplades sedan kovalent via amino-allyl UTP till antingen ett Cy3 eller Cy5 monoreaktivt färgämne enligt tillverkarens instruktioner (Amersham, Piscataway, NJ, USA). De märkta cDNA-proberna rengjordes sedan med PCR-reningskolonner enligt tillverkarens instruktioner (Qiagen, Valencia, CA, USA) förutom att bufferten PE ersattes med 80 % etanol. Proberna preparerades för hybridisering enligt standardprocedurer (se ovan webbplatser). Kortfattat bringades de rengjorda sonderna till en slutlig volym på 30 μl i en lösning innehållande 25 mmol l –1 Hepes-buffert pH 7,0, 0,75 mg ml –1 tRNA (Sigma), 3× SSC och 0,2 % SDS. Sonderna kokades i 2 minuter och fick svalna vid rumstemperatur under 5 minuter innan hybridiseringarna påbörjades. Prober sattes till mikroarrayen genom att placera LifterSlip (15 mm × 15 mm) täckglas över arrayen och använda kapillärverkan för att dra lösningen under täckglaset. Hybridiseringar utfördes vid 65°C över natten i Genomic Solutions (Ann Arbor, MI, USA) hybridiseringskammare. Varje hybridisering utfördes en gång för varje jämförelse. Ett totalt antal av 55 hybridiseringar är representerade i datamängden. Två dagliga cykler, separerade med 2 veckor, togs för kontrollförhållanden (26°C). Fem temperaturcykler provades för cyklisk temperaturacklimatisering, vilket resulterade i ett mycket konsekvent mönster av genuttryck under flera temperaturcykler.

Efter hybridisering tvättades arrayerna kort och försiktigt för att avlägsna eventuellt obundet färgämne och torkades sedan snabbt genom centrifugering (www.microarray.org). Kortfattat placerades objektglasen platt i en lösning av 0,6 x SSC och 0,03 % natriumdodecylsulfat (SDS) och täckglaset tvättades försiktigt bort från objektglaset. Objektglasen överfördes sedan till ett objektglasställ och doppades försiktigt 10 gånger i en färsk 500 ml behållare med samma tvättlösning. Objektglasen överfördes sedan individuellt och doppades försiktigt 10 gånger i en andra 500 ml tvättlösning innehållande 0,06 x SSC. Efter denna tvätt doppades objektglasen 5 gånger i 500 ml avjoniserat vatten och centrifugerades sedan torrt i en centrifug vid låg hastighet. De tvättade objektglasen skannades med en Axon GenePix 4000B mikroarrayskanner (Axon Instruments, Union City, CA, USA). Data extraherades från de skannade bilderna med hjälp av programvaran GenePix 4.0 (Axon Instruments). Datan matades sedan in i Stanford Microarray Database (SMD). Datafiltrering och sortering utfördes inom SMD-databasen. Vid inträde i databasen normaliserades all data för att balansera de övergripande nivåerna av Cy5 och Cy3 till ett 1:1-förhållande med användning av en enkel korrektionsfaktor applicerad på Cy5-data. För varje fläck på varje array valdes data ut för analys endast om de hade en Cy5/Cy3 fluorescensregressionskoefficient på >0,6 och hade en signalintensitet på 2,5 gånger bakgrunden. Dessa fläckar kallas "rättvisa" data. Denna metod för normalisering och definition av "rättvisa" data var standardinställningarna i SMD.

Dataanalys och presentation

Genuttrycksnivåer bestämdes vid varje tidpunkt genom att jämföra mängden mRNA-transkript närvarande i experimentprovet (poolat från fyra fiskar vid varje tidpunkt) jämfört med ett referensprov (poolat från över 400 fiskar som användes i experimentet). Användningen av ett referensprov gjorde det möjligt att jämföra den relativa mängden av varje transkript vid varje tidpunkt med ett gemensamt prov. Referensprover märktes rutinmässigt med Cy3 medan experimentella prover märktes med Cy5. Emellertid utfördes färgomvändningsexperiment för de två första dagliga temperaturcyklerna (12 prover) för att undersöka möjlig Cy Dye-bias i våra data och för att bedöma variationen i data (Fig. 2). Dessa färgomvändningsexperiment indikerar en mycket hög korrelation mellan dubbla hybridiseringar (r= 0,96), för cDNA-kloner som upplever förändringar i genuttryck större än dubbelt jämfört med referensproverna (fig. 2).

Replikera hybridiseringar och ömsesidiga färgmärkningsexperiment. (A) Dubbletthybridiseringar utfördes för varje tidpunkt i de två första temperaturcyklerna. Uttrycksdata filtrerades genom att endast acceptera fläckar som ändrades dubbelt under minst en tidpunkt. Dessa data är inte korrigerade i förhållande till t=0, men de är mediancentrerade. Cy3 användes för att märka referensprovet medan Cy5 användes för att märka det experimentella provet i framåt (F) hybridiseringar. Färgämnena reverserades (R) i den andra uppsättningen hybridiseringar. Visuell inspektion avslöjar ett starkt samband mellan de två uppsättningarna av hybridiseringar, särskilt för fläckar som förändras mer än dubbelt jämfört med referensen. (B) Det finns en stark korrelation mellan data för framåt- och bakåthybridiseringar (r=0,96) för fläckar på arrayen som ändras mer än dubbelt (N=831). Ekvationen för regressionslinjen på grafen är y=1.061x+0,04056. Dessa data indikerar att det inte finns någon signifikant färgämnesbias i denna datamängd. Vidare stöder det slutsatsen att förändringar i genuttryck som observerats i denna studie sannolikt inte beror på variation i hybridiseringar, utan istället är biologiskt relevanta.

Replikera hybridiseringar och ömsesidiga färgmärkningsexperiment. (A) Dubbletthybridiseringar utfördes för varje tidpunkt i de två första temperaturcyklerna. Uttrycksdata filtrerades genom att endast acceptera fläckar som ändrades dubbelt under minst en tidpunkt. Dessa uppgifter är inte korrigerade i förhållande till t=0, men de är mediancentrerade. Cy3 användes för att märka referensprovet medan Cy5 användes för att märka det experimentella provet i framåt (F) hybridiseringar. Färgämnena reverserades (R) i den andra uppsättningen av hybridiseringar. Visuell inspektion avslöjar ett starkt samband mellan de två uppsättningarna av hybridiseringar, särskilt för fläckar som förändras mer än dubbelt jämfört med referensen. (B) Det finns en stark korrelation mellan data för framåt- och bakåthybridiseringar (r=0,96) för fläckar på arrayen som ändras mer än dubbelt (N=831). Ekvationen för regressionslinjen på grafen är y=1.061x+0,04056. Dessa data indikerar att det inte finns någon signifikant färgämnesbias i denna datamängd. Vidare stöder det slutsatsen att förändringar i genuttryck som observerats i denna studie sannolikt inte beror på variation i hybridiseringar, utan istället är biologiskt relevanta.

Även om användningen av ett referensprov gav en gemensam jämförelsegrund för varje experimentellt prov, är data uttryckta i detta format inte nödvändigtvis biologiskt relevanta eftersom varje jämförelse är av ett experimentellt prov jämfört med medelnivån för varje transkript som uttrycktes under hela experimentera. Tolkning av dessa data är svår och därför valde vi att ytterligare anpassa data till en biologiskt relevant standard. Det finns flera sätt att justera data för detta ändamål, som var och en har sina egna styrkor och svagheter.

En vanlig teknik är att justera genuttrycksdata så att mediannivån för uttryck är lika med 0 på en logg2 skala för varje punkt på arrayen för alla behandlingar (dvs.ett förhållande på 1:1) kallas denna metod för "mediancentrering" (Eisen et al., 1998). Denna metod är logisk för jämförelser av olika celltyper eller celler under olika steady state-förhållanden, men enligt vår uppfattning var den inte lämplig för presentation av tidsförloppsdata på grund av det underliggande antagandet att medianexpressionsnivån för en given gen bör vara 0 på en stock2 skala. Till exempel, om en gen är starkt inducerad i alla tidpunkter som provats, skulle denna starka induktion representeras som mediannivån för genuttryck och skulle förmodligen orsaka att det verkliga uttrycksmönstret till stor del dämpas efter mediancentrering. Vi observerade denna typ av mönster för många molekylära chaperoner i denna studie.

En annan möjlighet, och kanske den mest logiska för tidsförloppsdata, är att justera alla uttrycksförhållanden så att de är relativt t=0. Denna metod förutsätter att den initiala tidpunkten representerar något fysiologiskt tillstånd av stabilt tillstånd i organismen som måste justeras som svar på den experimentella behandlingen. Emellertid är genuttrycksdata som presenteras på detta sätt beroende av högkvalitativa data för t=0 tidpunkt. Dessutom, om data saknas för t=0 tidpunkt då är det omöjligt att justera de andra tidpunkterna. Dessa problem kan till stor del undvikas genom att replikera t=0 hybridiseringar och med hjälp av genomsnittet av dessa replikat för att justera resten av datamängden. I vårt fall använde vi genomsnittet av två hybridiseringar från kontrollen (26°C, t=0 och t=336 h) för att justera datamängden i förhållande till initialtillståndet. Ett ytterligare problem med denna metod är att effekterna av temperatur inte är separerade från effekterna av normala dagliga rytmer i genuttrycksdata för temperaturcykling. I många fall var de naturliga rytmerna i genuttryck under exponering för konstant 26°C starka och maskerade effekterna av temperatur på genuttryck.

För att kontrollera för dagliga förändringar i genuttryck som inte var associerade med temperaturcykeln, normaliserade vi temperaturcykeldata till att vara relativt de dagliga kontrollmönstren för genuttryck (i genomsnitt två dagliga cykler vid 26 ° C). Denna operation "subtraherar" i själva verket de dagliga rytmerna i genuttryck som inte beror på temperatur från temperaturcykeldata. Denna operation gjordes genom att multiplicera Cy5:Cy3-förhållandet för varje experimentell tidpunkt i cykeltemperaturbehandlingen med Cy5:Cy3-förhållandet för motsvarande kontrolltidpunkt (t.ex. cykling) t=4 h multiplicerat med kontroll t=4 h). Vi har kallat denna permutation av data för 'temperaturens effekt'. Data presenterade på detta sätt illustrerar nettoeffekten av temperatur på de naturliga mönstren för genuttryck. Dessa data kan dock vara vilseledande om de inte presenteras korrekt. Till exempel, om det finns en stark dygnsrytm i genuttryck som inte påverkas av temperatur, kommer detta att resultera i ett platt dagligt uttrycksmönster när det presenteras på detta sätt, även om genen kan förändras flera gånger varje dag. Därför har vi valt att presentera data i två format i denna uppsats, i förhållande till t=0 och efter subtraktion av dagliga rytmer, eftersom varje metod för datapresentation har styrkor och illustrerar olika komponenter i datamängden.

Korskorrelationsanalys (Chatfield, 1989) användes för att bestämma om genuttrycksmönster var signifikant korrelerade med temperaturcykeln. Med denna metod är det möjligt att identifiera fasförskjutningen i data som ger den högsta korrelationskoefficienten, och därmed det mest signifikanta sambandet mellan genuttrycksmönster och temperaturmönster. Korrelationskoefficienter identifierades som statistiskt signifikanta på nivån 0,05.

Data för genuttrycksförhållandet klustrades enligt likhet i uttrycksmönster med användning av Cluster-mjukvara (Eisen et al., 1998). Pearson icke-centrerad, fullständig länkhierarkisk klustring användes för att organisera data. Visualisering av klustrade data åstadkoms med hjälp av programvaran TreeView (Eisen et al., 1998).

DNA-sekvensering

Mikroarrayfläckar med intressanta uttrycksmönster identifierades genom att sekvensera cDNA-insättningen isolerad från plasmid-DNA från klonen av intresse. Sekvensering åstadkoms med användning av en ABI 373-sekvenserare med färgämnesterminatorreaktionsblandning. Plasmidspecifika primrar användes för sekvenseringsreaktionerna. Alla cDNA av intresse sekvenserades från 5'-änden för att maximera möjligheten att identifiera transkriptet. Sekvenser identifierades genom homologi med kända sekvenser med användning av en NCBI Blastx-sökning i GenBank-databasen. De mest signifikanta eller relevanta resultaten av dessa Blast-sökningar såväl som GenBank-accessionsnumren för sekvenserade cDNA-kloner som presenteras i detta dokument finns tillgängliga i tilläggstabell 1.


Introduktion

Parasitoid attack är en viktig orsak till dödlighet hos många insektsarter (Godfray och Shimada 1999 Asgari och Rivers 2011), och utövar ett starkt urval av egenskaper som påverkar sannolikheten eller resultatet av en attack. Försvarsmekanismer mot endoparasitoider som fullbordar sin utveckling inuti värden involverar ofta värdens immunsystem, som utvecklas snabbt som svar på den förändrade virulensen hos endoparasitoider och visar stor variation mellan arter (Carton et al. 2008). Till exempel, Drosophila arter visar stor variation i immunokompetens mot parasitoiden Asobara tabida, där de flesta arter i Drosophila obscura grupp visar immunbrist och ingen ägginkapsling, medan andra taxa visar mycket starka immunsvar (Eslin och Doury 2006 Havard et al. 2009 Singh et al. 2009 Salazar-Jaramillo et al. 2014). Liknande mönster har nyligen dokumenterats i bladbaggarsläktet Galerucella, där tre närbesläktade arter som delar en gemensam parasitoid getingfiende skiljer sig åt vad gäller parasitismhastighet, inkapslingsframgång och hemocytproduktion (Fors et al. 2014, 2016).

Den cellulära basen som ligger bakom variationen i immunkompetens mot endoparasitoider hos icke-modellinsekter som t.ex. Galerucella är i stort sett lik Drosophila (Fors et al. 2014). I allmänhet börjar immunsvaret efter en parasitoid attack med igenkännandet av parasitoidägget. Immunsignaler inducerar därefter en snabb ökning och differentiering av hemocyter som fäster på äggytan, vilket leder till bildandet av en kapsel runt ägget med flera lager av hemocyter (Carton et al. 2008). I Drosophila, involverar denna inkapslingsprocess tre huvudtyper av hemocyter: plasmatocyter, lamellocyter och kristallceller. Plasmatocyter är huvudsakligen ansvariga för fagocytos och utgör majoriteten av cirkulerande hemocyter (>95%). Den senare består också av en liten andel kristallceller (<5%), som innehåller kristallina enzymer som krävs för humoral melanisering (Schmid et al. 2019). Slutligen produceras lamellocyter specifikt efter attack av parasitoider och deltar i kapselbildning (Lavine och Strand 2002 Meister och Lagueux 2003). Inkapsling slutar ofta med melanisering, vilket är frisättning och aktivering av fenoloxidas, vilket leder till svärtning vid sårstället eller runt det inkapslade ägget (Honti et al. 2014). Parasitägg inuti kapseln dör normalt av kvävning inom 48 timmar, under den gemensamma effekten av inkapsling och melanisering (Wertheim et al. 2005).

I Galerucella, sex typer av hemocyter har upptäckts baserat på deras morfologier, och tre (lamellocyter, fagocyter och granulocyter) var specifikt involverade i inkapslingsprocessen (Fors et al. 2014). Lamellocyter, som har samma funktion som i Drosophila melanogaster, är väsentliga för att kapselbildningen ska fullbordas. Fagocyter, även om de inte är den viktigaste faktorn, bidrar också till inkapslingsprocessen i Galerucella (Carton et al. 2008 Fors et al. 2014). Slutligen kommer granulocyter in Galerucella dela sitt utsöndringssätt med kristallceller i Drosophila ( Fors et al. 2014), som är involverade i sår- och kapselmelanisering.

Även om hemocyterna som ligger till grund för insektsimmunsvar till stor del karaktäriseras, är deras reglering endast delvis förstådd och kännetecknas främst av Drosophila. Generna som är involverade i immunsvar kan klassificeras i sju funktionella kategorier, som föreslagits av Salazar-Jaramillo et al. (2014). Den första klassen av gener involverar igenkänningsgener, till exempel peptidoglykanigenkänningsproteiner (PGRP) och gramnegativa bakteriebindande proteiner som är involverade i igenkänningen av främmande föremål, såsom parasitoidägg. Den andra klassen av gener involverar signalgener för transduktionsvägar (Toll, JAK-STAT, JNK och IMD) som initierar spridningen av hemocyter som behövs för att kapsla in det främmande föremålet. Den tredje klassen involverar effektorgener som kodar för antimikrobiella peptider som riktar sig mot bakterie- eller svampmembran, vilket leder till skada på membranet och cellens död (Bulet et al. 1999). Den fjärde klassen av gener involverar modulering av gener som kodar för serpiner och serinproteaser med mestadels okänd immunfunktion (t.ex. Spn88Eb). Den femte klassen omfattar hematopoiesgener som är specifikt involverade i parasitoidrelaterad immunitet (hemocytdifferentiering, proliferation och reglering av hematopoiesisprocess, t.ex. gcm, wg, och yantar). Den sjätte kategorin inkluderar gener som kodar för propenoloxidaser och deras regulatorer (t.ex. PPO3, gul), som producerar såväl cytotoxiska som tvärbindande mellanprodukter och i slutändan melanin som behövs för att fullborda kapseln runt parasitägget. Den sista klassen av gener är huvudsakligen de som kodar för kitinaser som är ansvariga för läkning av sår efter parasitoid äggläggning. Belysningen av dessa gener och vägar har avsevärt underlättat vår förståelse av den evolutionära dynamiken som verkar på gener involverade i antiparasitoid immunitet, men deras förekomst och relevans utanför Drosophila arter har fått lite uppmärksamhet.

Ett kraftfullt tillvägagångssätt för att förstå skillnader i immunsvar är att jämföra genuttrycksmönster mellan närbesläktade arter som skiljer sig i sin immunkompetens. Här undersökte vi skillnader i genuttryck efter parasitoid attack i de närbesläktade skalbaggarna Galerucella pusilla och G. calmariensis (Coleoptera: Chrysomelidae). De delar samma värdväxt, Lythrum salicaria (Lythraceae) och attackeras av samma koinobiontlarvparasitoid, Asecodes parviclava (Hymenoptera: Eulophidae) (Fors et al. 2014). Dessa arter valdes ut för studier eftersom de uppvisar stora skillnader i sin förmåga att kapsla in parasitoida ägg, trots att de först nyligen avvikit från en gemensam förfader (Hambäck et al. 2013 Fors et al. 2014). Parasitismfrekvensen på de två värdarterna varierar mellan lokaliteter men i allmänhet, G. pusilla upplever en lägre parasitism än G. calmariensis om de uppstår samtidigt (Fors et al. 2014). Både inkapslings- och melaniseringshändelser är mycket vanliga i G. pusilla larver infekterade av getingar, medan i G. calmariensis, kapselbildning och melanisering av getingägg observeras sällan. Om inkapslingen sker framgångsrikt vid parasitism, börjar kapselbildningen vanligtvis inom 4–6 timmar och är avslutad efter ~48 timmar (Fors et al. 2014). Under inkapslingsprocessen är kapseln ofta melaniserad och melaniserade parasitägg kan tydligt observeras vid matsmältning efter 48 timmar. Sårläkning sker vanligtvis snabbt på sårställena inom de första timmarna efter parasitism, där melanisering också spelar en roll för att såret svärtas. I allmänhet, G. pusilla utövar ett mer potent immunsvar mot A. parviclava än G. calmariensis, med undersökningar på cellnivå som dokumenterar att två klasser av hemocyter involverade i inkapsling, fagocyter och lamellocyter, ökade deras produktion vid infektion i G. pusilla (Fors et al. 2014). För att gå bortom cellulär fenotypnivåstudie undersökte vi här skillnader i genuttrycket mellan dessa två arter, med hjälp av en tidsförloppsprovtagningsdesign efter parasitoid attack. Utöver heltranskriptomnivåanalyser fokuserade vi också på kommenterade immungener baserat på tidigare kunskap från D. melanogaster och andra artropodarter (Wertheim et al. 2005 Tribolium Genome Sequencing Consortium 2008). Baserat på det tidigare arbetet förväntade vi oss att fler immungener, särskilt hematopoiesisgener, skulle uttryckas differentiellt efter parasitoidangrepp hos arten med det starka immunsvaret, G. pusilla.


3.8.3 Använda genomprojekt (endast A-nivå)

Möjligheter till kompetensutveckling

Sekvenseringsprojekt har läst genomen för ett brett spektrum av organismer, inklusive människor.

Genom att bestämma genomet för enklare organismer kan sekvenserna för proteinerna som härrör från organismens genetiska kod (proteomet) bestämmas. Detta kan ha många tillämpningar, inklusive identifiering av potentiella antigener för användning i vaccinproduktion.

I mer komplexa organismer innebär närvaron av icke-kodande DNA och av regulatoriska gener att kunskap om genomet inte enkelt kan översättas till proteomet.

Sekvenseringsmetoder uppdateras kontinuerligt och har blivit automatiserade.


DISKUSSION

Det har föreslagits att AICD har en viktig biologisk roll i utvecklingen av AD-patologi genom sin förmåga att fungera som en klyvningsprodukt med transaktiveringspotential (Cao och Sudhof, 2001). Fram till nu hade få AICD-beroende kandidatgener beskrivits, och en genomomfattande metod för screening saknades. I denna studie etablerade vi en inducerbar neuroblastomcellodlingsmodell med AICD, FE65 eller AICD och FE65 under kontroll av en tetracyklin-responsiv promotor. Analys av transkriptionsförändringar efter uttryck av AICD och/eller dess kofaktor FE65 med användning av Affymetrix U133A GeneChips avslöjade en lista med 182 förmodade AICD-målgener (se tilläggstabell).

Kvantitativ PCR i realtid av utvalda gener visade att vissa gener var beroende av induktion av enbart AICD, andra visade förhöjt uttryck när FE65 samuttrycktes, medan en tredje delmängd endast reglerades differentiellt efter uttryck av både AICD och FE65.

Fe65-oberoende signalering kan förklaras av direkt bindning av AICD till TIP60 (Kinoshita et al.2002). Men majoriteten av målgener som beskrivs i detta arbete visade ett krav på samuttryck av FE65, vilket tyder på en viktig roll för detta bindande protein i AICD-beroende genuttryck, en observation som också har rapporterats av andra studier (Cao och Sudhof, 2001) von Rotz et al., 2004). Det finns faktiskt bevis för att bindning av FE65 till AICD är nödvändig för nukleär translokation (Kimberly et al., 2001 Muresan och Muresan, 2004 von Rotz et al., 2004). Två olika AICD transkriptionellt aktiva komplex baserade på bindningen av AICD-FE65 till TIP60 och till CP2/LSF/LBP1 har föreslagits (Cao och Sudhof, 2001 Kim et al., 2003). TIP60 är en del av ett stort kärnkomplex med DNA-bindning, ATPas och DNA-helikasaktivitet (Ikura et al.2000). I Gal4 reportergenexperiment är det ternära komplexet AICD-FE65-TIP60 en potent transaktivator, beroende på expressionsnivån för FE65 (Cao och Sudhof, 2001). En alternativ mekanism baserad på strukturella modifieringar av FE65 av AICD har föreslagits som inte kräver AICD-translokation från cytoplasman till kärnan (Cao och Sudhof, 2004). Denna hypotes står inte i motsats till våra fynd, eftersom förhöjda cytosoliska nivåer av AICD kan vara tillräckliga för att orsaka en förändring i konformationen av FE65. Detta andra ternära komplex (AICD-FE65-CP2/LSF/LBP1) föreslogs för att modulera uttryck av glykogensyntaskinas-3β (Kim et al., 2003). Därför kan olika AICD-transkriptionskomplex förklara olika regleringsmönster.

Långtidsinduktion av ektopiskt uttryckta gener kan resultera i sekundära regleringseffekter eftersom primära inducerade gener i sig kan fungera som aktivator för andra gener. Därför använde vi 72-timmarsinduktion (dox-tvättning) för våra studier motsvarande den tidigaste tidpunkten för mätbar induktion av AICD och/eller FE65. Under dessa förhållanden observerade vi inte differentiell reglering av tidigare beskrivna AICD-målgener såsom KAI1 (tabell 2). Vi kunde inte detektera reglering av andra förmodade målgener, inklusive SERCA2B (Leissring et al.2002) eller GSK3p (Kim et al., 2003). Våra data överensstämmer dock med andra grupper som inte kunde detektera AICD-beroende reglering av dessa gener i AICD/FE65-transgena möss (Ryan och Pimplikar, 2005) eller i cellinjer med farmakologisk hämning eller brist på γ-sekretasaktivitet (Hebert et al., 2006). Dessutom är det troligt att differentiellt genuttryck av AICD-mål sker på ett celltypsspecifikt sätt och är beroende av uttrycksnivåer av endogena kofaktorer. Vårt arbete är den första studien som analyserar AICD-beroende genuttryck i stabila transfekterade SHEP-SF neuroblastomceller. Viktigt är att primära kortikala neuroner övergående transfekterade med AICD50/FE65 visade också ökat uttryck av TAGLN, TPM1 vilket stöder hypotesen om en roll för AICD vid reglering av uttrycksnivåerna för dessa gener. Dessutom, med tanke på de framväxande bevisen för en roll för AICD-signalering i patofysiologin för AD, kunde vi verifiera differentiellt uttryck av flera av AICD-målgenerna som beskrivs i detta arbete i frontala cortex av Alzheimers sjukdom kontra kontrollhjärnor. α2-Actin, IGFBP3 och TAGLN uttrycktes signifikant högre i AD-hjärnor jämfört med deras åldersmatchade kontroll. Intressant nog har IGFBP3 tidigare beskrivits vara associerad med neurofibrillära trassel i AD-hjärnor (Rensink et al.2002). Dessutom har andra grupper också rapporterat differentiellt uttryck av PRKC (Par-4) (El Guendy och Rangnekar, 2003) och TPM1 (Galloway) et al., 1990) i AD-hjärnprover jämfört med hjärnor från opåverkade patienter. Dessutom neuritiska plack positiva för neuregulin (Chaudhury et al.2003) och fibronektin 1 (Van Gool et al.1994) har visats genom immunhistokemi.Med tanke på att flera av våra AICD-målgener tidigare har visat differentiella uttrycksnivåer under AD-progression, är det intressant att postulera att ökat uttryck av AICD, och dess mål, kan spela en viktig roll i AD. Däremot kunde vi inte bekräfta differentiell reglering för KAI1 och andra diskuterade målgener i AD-hjärnor kontra kontroller.

Bland de AICD-beroende reglerade generna identifierade vi flera kandidater som tidigare har beskrivits som regulatorer av aktindynamiken, inklusive α2-Actin, Transgelin och Tropomyosin 1. Transgelin, ett aktin-tvärbindande protein, är involverat i organisationen av aktincytoskelett och tros koppla åldrande till aktinstabilitet (Goodman et al., 2003 Nakano et al., 2005). Andra gener som Fibronectin1 och RAB3B beskrevs också vara associerade med cytoskelettorganisation. Visualisering av F-aktinstrukturer i neuroblastomceller såväl som i kortikala neuroner efter AICD- och FE65-uttryck avslöjade disorganisering av aktinfibrer i cellkroppen och klumpar av aktinfibrer i periferin, vilket tyder på ökad aktindynamik. Med tanke på att denna fenotyp saknades i celler som uttrycker FE65 utan AICD, tyder våra resultat på att denna signalering sker oberoende av familjen av Ena/Vasp-proteiner, som interagerar med WW-domänerna av FE65-proteiner (Ermekova) et al.1997). Däremot tyder våra data på att AICD-beroende transaktivering är ansvarig för omorganiseringen av aktinfilament, och därför kan spela en viktig roll under utveckling och i omorganisation av cellulära strukturer som svar på skada. Dessutom är APP i sig transkriptionellt uppreglerad som svar på nervtransektioner, trauma och cerebral ischemi i nervsystemet (Banati et al.1993 Shi et al., 2000 Ciallella et al., 2002), alla processer som resulterar i cytoskelettomorganisation. I DrosophilaAPP-uttryck är associerat med ökningar i postutvecklingsmässig axonal arborisering och förlust av neuronala anslutningar, vilket var strikt kopplat till den intracellulära domänen av APP (Leyssen et al., 2005). Dessutom är Tg2576 transgena möss från så tidigt som 4 månader gamla positiva för stavliknande inneslutningar i den bakre cortex som är sammansatta av aktin (Maloney et al., 2005). En modell där APP och FE65 är involverade i den komplexa regleringen av aktinbaserad tillväxtkonmotilitet stöds också av andra data (Sabo et al., 2003). Intressant nog är blockering av axonal transport, som kan vara ett resultat av oorganiserat cytoskelett, den tidigaste uppmätta störningen i hjärnan hos transgena möss som uttrycker mutant human APP (Stokin) et al., 2005). Dessutom visar nyare studier att meningeala fibroblaster från FE65 −/− plus F65L1 −/− möss visar ett stört F-aktinmönster jämfört med vildtypsmöss (Guenette et al., 2006). Tillsammans antyder vår studie en viktig roll för AICD i regleringen av cellulär aktindynamik.


16.6 Eukaryot translationell och posttranslationell genreglering

I slutet av det här avsnittet kommer du att kunna göra följande:

  • Förstå översättningsprocessen och diskutera dess nyckelfaktorer
  • Beskriv hur initieringskomplexet styr översättningen
  • Förklara de olika sätten på vilka den posttranslationella kontrollen av genuttryck sker

Efter att RNA har transporterats till cytoplasman översätts det till protein. Kontroll av denna process är till stor del beroende av RNA-molekylen. Som tidigare diskuterats kommer stabiliteten hos RNA:t att ha en stor inverkan på dess translation till ett protein. När stabiliteten ändras ändras också hur lång tid den är tillgänglig för översättning.

Initieringskomplexet och översättningshastigheten

Precis som transkription styrs translation av proteiner som binder och initierar processen. I översättning kallas komplexet som sätts samman för att starta processen som översättningsinitieringskomplexet. I eukaryoter initieras translation genom att binda den initierande met-tRNAi till 40S-ribosomen. Detta tRNA förs till 40S-ribosomen av en proteininitieringsfaktor, eukaryot initieringsfaktor-2 (eIF-2). eIF-2-proteinet binder till högenergimolekylen guanosintrifosfat (GTP). tRNA-eIF2-GTP-komplexet binder sedan till 40S-ribosomen. Ett andra komplex bildas på mRNA. Flera olika initieringsfaktorer känner igen 5'-kapseln av mRNA:t och proteiner bundna till poly-A-svansen av samma mRNA, vilket bildar mRNA:t till en loop. Det cap-bindande proteinet eIF4F för samman mRNA-komplexet med 40S-ribosomkomplexet. Ribosomen skannar sedan längs mRNA tills den hittar ett startkodon AUG. När antikodonet för initiator-tRNA:t och startkodonet är inriktade, hydrolyseras GTP, initieringsfaktorerna frisätts och den stora 60S ribosomala subenheten binder för att bilda translationskomplexet. Bindningen av eIF-2 till RNA:t kontrolleras av fosforylering. Om eIF-2 är fosforylerad genomgår den en konformationsförändring och kan inte binda till GTP. Därför kan initieringskomplexet inte bildas ordentligt och translation försvåras (Figur 16.13). När eIF-2 förblir ofosforylerat kan initieringskomplexet bildas normalt och translation kan fortsätta.

Visuell anslutning

En ökning av fosforyleringsnivåer av eIF-2 har observerats hos patienter med neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons. Vilken inverkan tror du att detta kan ha på proteinsyntesen?

Kemiska modifieringar, proteinaktivitet och livslängd

Proteiner kan modifieras kemiskt med tillägg av grupper inklusive metyl-, fosfat-, acetyl- och ubikvitingrupper. Tillägget eller avlägsnandet av dessa grupper från proteiner reglerar deras aktivitet eller hur lång tid de existerar i cellen. Ibland kan dessa modifieringar reglera var ett protein finns i cellen - till exempel i kärnan, i cytoplasman eller fäst vid plasmamembranet.

Kemiska förändringar sker som svar på yttre stimuli som stress, brist på näringsämnen, värme eller exponering för ultraviolett ljus. Dessa förändringar kan förändra epigenetisk tillgänglighet, transkription, mRNA-stabilitet eller translation – allt vilket resulterar i förändringar i uttryck av olika gener. Detta är ett effektivt sätt för cellen att snabbt ändra nivåerna av specifika proteiner som svar på miljön. Eftersom proteiner är involverade i varje skede av genreglering, kan fosforyleringen av ett protein (beroende på proteinet som är modifierat) förändra tillgängligheten till kromosomen, kan förändra translation (genom att ändra transkriptionsfaktorbindning eller funktion), kan ändra nukleär shuttling ( genom att påverka modifieringar av kärnporkomplexet), kan förändra RNA-stabiliteten (genom att binda eller inte binda till RNA:t för att reglera dess stabilitet), kan modifiera translation (öka eller minska), eller kan ändra posttranslationella modifieringar (lägga till eller ta bort fosfater eller andra kemiska modifieringar).

Tillägget av en ubiquitingrupp till ett protein markerar att proteinet bryts ned. Ubiquitin fungerar som en flagga som indikerar att proteinets livslängd är komplett. Dessa proteiner flyttas till proteasomen, en organell som fungerar för att avlägsna proteiner, för att brytas ned (Figur 16.14). Ett sätt att kontrollera genuttrycket är därför att ändra proteinets livslängd.


3. Resultat

3.1. A. phagocytophilum modulerar genuttryck i infekterade I. scapularis-nymfer och fästing ISE6-celler

Infektionen med A. marginal har visats modulera fästinggenexpression [9]. Men effekten av A. phagocytophilum infektion på fästinggenexpression är okänd. Här användes två experimentella tillvägagångssätt för att karakterisera genuttrycksprofiler i fästingceller infekterade med A. phagocytophilum. I det första tillvägagångssättet karakteriserades fästinggenexpression av mikroarrayanalys av RNA från infekterade och oinfekterade fästing ISE6-celler. I det andra tillvägagångssättet identifierades gener som differentiellt uttrycks i fästing IDE8-celler och fästingar infekterade med A. marginal användes för att karakterisera effekten av A. phagocytophilum på fästinggenuttryck hos infekterade I. scapularis nymfer och fästing ISE6-celler genom RT-PCR i realtid.

Mikroarrayanalysen visade in A. phagocytophilum-infekterade fästing ISE6-celler uppreglering av generna C4B10 med homologi till von Willebrand-faktor och R1E12 med homologi till ribosomalt protein L32, C4A10, C3C3, C4A1 och C3D9 med okänd funktion och nedreglering av generna C3B2 med homologi till en asparaginsyra-2proteas och R2A , C3A7, R2G1, R2D6, C3C11 och R3D4 med okänd funktion (tabell 2). Expressionen av andra gener med homologi med troponin I (C2E6), förmodat utsöndrat salivprotein (C4G3) och ML-domäninnehållande protein (R4G5) förändrades inte efter infektion av fästing ISE6-celler med A. phagocytophilum ( Tabell 2 ).

Tabell 2

Mikroarrayanalys av genuttrycksprofil i A. marginal- och A. fagocytophilum-infekterade och -oinfekterade fästing ISE6-celler.

Sond-ID (a) Beskrivning (b) A. marginal infektion kontra kontroll A. phagocytophilum infektion kontra kontroll
Vikbyte (c) SD (d) Vikbyte (c) SD (d)
C4A10Ingen homolog hittades6.2490.0002.2080.294
R1A6Ingen homolog hittades2.5390.1621.0490.346
C3C5[Genbank: <"type":"entrez-nukleotid","attrs":<"text":"L22271","term_id":"347817","term_text":"L22271">> L22271] internt transkriberat spacer 1 (Ixodes dammini)2.4061.2111.3830.000
C4A8Ingen homolog hittades2.2390.1651.1880.442
R3A7Ingen homolog hittades2.2090.805𢄡.3840.562
C4G3[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAY66629","term_id":"67083387","term_text":"AAY66629">> AAY66629] förmodat utsöndrat salivprotein (Ixodes scapularis)2.1670.3261.0370.614
C2E6[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"ABB89211","term_id":"82698821","term_text":"ABB89211">> ABB89211] troponin I-protein (Rhipicephalus haemaphysaloides)2.0400.400𢄡.0680.442
C3C3Ingen homolog hittades1.9160.5593.4221.037
C4A1Ingen homolog hittades1.8570.0002.1210.517
R2A12Ingen homolog hittades1.1990.232𢄢.2190.450
C3A7Ingen homolog hittades1.1350.282𢄣.0280.141
C3D9[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"XP_791420","term_id":"72037502","term_text":"XP_791420">> XP_791420] hypotetiskt protein (Strongylocentrotus purpuratus)1.0760.3354.8752.069
C3B2[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"BAE53722","term_id":"83319201","term_text":"BAE53722">> BAE53722] asparaginsyraproteas (Haemaphysalis longicornis)𢄡.3110.330𢄦.9860.379
R2G1Ingen homolog hittades𢄡.4970.495𢄢.0860.826
R2D6Ingen homolog hittades𢄡.5380.309𢄢.4400.563
C3C11Ingen homolog hittades𢄢.0530.401𢄢.4770.488
C4D12Ingen homolog hittades𢄢.0660.547𢄡.0220.533
R4G5[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAP84098","term_id":"32481528","term_text":"AAP84098">> AAP84098] ML-domäninnehållande protein (Ixodes ricinus)𢄢.0660.1611.0200.266
C4C9[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAH56007","term_id":"33417096","term_text":"AAH56007">> AAH56007] H13-prov protein (Xenopus laevis)𢄢.0700.2701.0810.689
C4G11[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"EAA09467","term_id":"157017076","term_text":"EAA09467">> EAA09467] ENSANGP00000010016 (Anopheles gambiae)𢄢.0930.550𢄡.1930.598
C4G9Ingen homolog hittades𢄢.0950.402𢄡.5980.888
R3F5[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAY66764","term_id":"67083657","term_text":"AAY66764">> AAY66764] förmodat utsöndrat salivprotein (Ixodes scapularis)𢄢.1180.310𢄡.0370.320
R3G4Ingen homolog hittades𢄢.2920.2591.0900.415
R1F3Ingen homolog hittades𢄢.3390.570𢄡.3440.855
R1E12[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"NP_001119682","term_id":"187115162","term_text":"NP_001119682">> NP_001119682 L32 (ribosomalt proteinAcyrthosiphon pisum) 𢄢.3790.0002.4880.000
C3F10[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAM93633","term_id":"22164256","term_text":"AAM93633">> AAM93633] förmodat utsöndrat protein (Ixodes scapularis)𢄢.3860.545𢄡.6470.315
R3D4Ingen homolog hittades𢄢.5291.046𢄢.3770.518
C4D2Ingen homolog hittades𢄢.7020.8601.0430.972
R3F4Ingen homolog hittades𢄢.9280.2981.1740.396
C1H10Ingen homolog hittades𢄣.3410.307𢄡.0570.000
C4A4Ingen homolog hittades𢄣.6781.181𢄡.4300.331
C4E12[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAY66942","term_id":"67084015","term_text":"AAY66942">> AAY66942] ribosomalt protein S17 (Ixodes scapularis)𢄣.9640.8221.4300.993
C4B10[Genbank: <"type":"entrez-protein","attrs":<"text":"AAQ01562","term_id":"33285889","term_text":"AAQ01562">> AAQ01562] av Willebrand factor (Ixodes ricinus)𢄤.4220.0002.4130.000

(a) Sond-ID (biblioteksplatta och brunn) identifierar prov (klon) i lagerplattor.

(b) Beskrivning av sonden baserat på topp (bästa) BLASTX-inriktning.

(c) Vikningsförändring är veckförändringen av Lågintensitetsberoende normaliserat log2-förhållande av giltiga bakgrundskorrigerade medelvärden som medelvärde mellan giltiga replikat. Endast poster som visar ett uttryck ändras mer än 2 gånger och P < .05 i någondera A. phagocytophilum eller A. marginal infekterade celler visas. Positiva och negativa värden motsvarar gener som uppregleras respektive nedregleras i infekterade celler.

(d) SD är standardavvikelsen som bestäms från det normaliserade genomsnittliga log2-förhållandet men bestäms endast på data från giltiga fläckar.

mRNA-nivåerna av utvalda gener differentiellt uttryckta i A. phagocytophilum-infekterade fästing-ISE6-celler utvärderades med realtids-RT-PCR i infekterade och oinfekterade celler (Figur 1). I likhet med mikroarrayhybridiseringsresultat visade analysen av mRNA-nivåer med realtids-RT-PCR signifikant uppreglering av C4B10 (von Willebrand-faktor) och R1E12 (ribosomalt protein L32) och nedreglering av C3B2 (asparaginproteas) i fästing ISE6-celler infekterade med A. phagocytophilum ( Figur 1 ). mRNA-nivåerna av gener som tidigare identifierats som differentiellt uttryckta i fästing-IDE8-celler och fästingar infekterade med A. marginal [9] utvärderades också med realtids-RT-PCR i infekterade och oinfekterade fästing ISE6-celler. mRNA-nivåerna av gener differentiellt uttryckta i A. marginal-infekterade ISE6-celler liknade de som tidigare rapporterats i infekterade IDE8-celler [9] och data visas inte. Resultaten i A. phagocytophilum-infekterade ISE6-celler visade att patogeninfektion signifikant uppreglerade uttrycket av U2A8 (signalsekvensreceptor delta), 1I5B9 (ixodegrin-2A RGD-innehållande protein) och 1I4G12 (okänd funktion) och nedreglerade uttrycket av 2I3A7 (NADH-ubiquinoe-oxidoreduktas) och 1I1H6 (glutation S-transferas (GST)) i fästing ISE6-celler (Figur 1).

Differentiellt genuttryck i A. phagocytophilum-infekterad I. scapularis fästingar och ISE6-celler från odlade fästingar. Realtids-RT-PCR gjordes på oinfekterade och infekterade I. scapularis nymfer (tre grupper vardera av oinfekterade fästingar, infekterade fästingar (Gaillard-stam svarta staplar) och infekterade fästingar (Dawson-stam vita staplar) med 10 nymfer vardera) och oinfekterade och NY18 isolatinfekterade fästingar ISE6-celler (tre oberoende kulturer vardera röda staplar). Staplar representerar förhållandet mellan infekterade normaliserade Ct-värden/oinfekterade genomsnittliga normaliserade Ct-värden (+SD). mRNA-nivåerna normaliserades mot fästing β-aktin (ACT) och jämförs mellan infekterade och oinfekterade fästingar och fästingceller av Students t-test (*P ≤ .05).

Uttrycket av utvalda gener analyserades också i I. scapularis nymfer infekterade med två olika A. phagocytophilum stammar (Figur 1). I I. scapularis nymfer, uttrycket av C4G3 (förmodat utsöndrat salivprotein), C4B10 (von Willebrand-faktor), R1E12 (ribosomalt protein L32) och R4G5 (ML-domäninnehållande protein) uppreglerades signifikant, och uttrycket av U2A8 (signalsekvensreceptor delta ), UP8 (ferritin), 2I3A7 (NADH-ubiquinoe-oxidoreduktas), 2I3A3 (gamma-aktinliknande protein), 2IP10 (ubiquitin C-variant 5-liknande), 1I5B9 (ixodegrin-2A RGD-innehållande protein), 1I1H6 (GST), C2E (troponin I), C3B2 (asparaginsyraproteas) och 1I4G12 och 1I3H6 med okänd funktion nedreglerades signifikant. Intressant nog var mRNA-nivåerna liknande i I. scapularis nymfer infekterade med två olika stammar av A. phagocytophilum men skilde sig från de som erhölls i infekterade ISE6-celler för vissa gener såsom U2A8, 1I5B9, 1I4G12, C2E6, C4G3 och R4G5 (Figur 1).

3.2. Differentiellt genuttryck i A. phagocytophilum-infekterade I. scapularis-nymfer och ISE6-celler skilde sig från det som observerades efter A. marginale-infektion

Resultaten som rapporterats häri visade att genuttrycksprofiler var olika för A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade fästingceller (figur 2 och ​ och 3). 3). Mikroarrayanalysen i infekterade och oinfekterade fästing ISE6-celler visade att uttrycket av gener med homologi med intern transkriberad spacer 1 (prob C3C5), förmodat utsöndrat salivprotein (C4G3), troponin I (C2E6), asparaginproteas (C3B2), ML-domän -innehållande protein (R4G5), H13-prov protein (C4C9), ribosomalt protein L32 (R1E12), förmodat utsöndrat protein (C3F10), ribosomalt protein S17 (C4E12), von Willebrand faktor (C4B10) och sekvenser med okänd funktion (R1A6) , C4A8, R3A7, R2A12, C3A7, C3D9, R2D6, C3C11, R3G4, R1F3, C4D2, R3F4, C1H10, C4A4) var olika mellan A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade celler (Figur 2). Uttrycket av andra gener förändrades på liknande sätt efter infektion av fästing ISE6-celler med A. marginal eller A. phagocytophilum (C4A10, C3C3, C4A1, R2G1, C4D12, C4G11, C4G9, R3F5, R3D4 Figur 2).

Effekten av A. phagocytophilum och A. marginal infektion på fästing ISE6-cellers genuttryck. Totalt RNA extraherades från tre A. marginal-smittad, tre A. phagocytophilum-infekterade och tre oinfekterade ISE6-cellkulturer. Expressionsveckförändringen bestämdes genom mikroarray-hybridisering 6 dagar efter infektion (dpi) (ungefär 70 % infekterade cellkompanjonskulturer var terminala vid 8 dpi). Oinfekterade celler togs prov vid samma tidpunkt som infekterade celler för att ta hänsyn till odlingstidseffekter. Kvoten beräknades som Anaplasma-infekterade celler kontra oinfekterade kontrollceller.Normaliserade kvotvärden som erhölls för varje sond togs i medeltal över 3 biologiska replikat och fyra tekniska replikat och endast poster som visade en signifikant (P ≤ .05) expression fold change Ϣ i antingen A. phagocytophilum- eller A. marginal-infekterade celler visas. Klon-ID (biblioteksplatta och brunn) visas. Grafen konstruerades med programvaran HCE (http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/hce3.html).

Effekten av A. phagocytophilum och A. marginal infektion på fästing ISE6-cellers genuttryck. mRNA-nivåerna jämfördes mellan A. phagocytophilum- (vita staplar) och A. marginal- (svarta staplar) infekterade fästing ISE6-celler genom RT-PCR i realtid. Staplar representerar förhållandet mellan infekterade normaliserade Ct-värden och oinfekterade genomsnittliga normaliserade Ct-värden (+SD). mRNA-nivåerna normaliserades mot fästing 16S rRNA och jämfördes mellan A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade fästingceller av Student's t-test (*P ≤ .05). Positiva och negativa värden betecknar uppreglering respektive nedreglering med avseende på oinfekterade kontroller.

Genom RT-PCR i realtid, mRNA-nivåerna av U2A8 (signalsekvensreceptor delta), 2I3G1 (proteasom 26S-subenhet, icke-ATPas), 2I3A3 (gamma-aktinliknande protein), 2I1F6 (hematopoetiska stam-/progenitorceller proteinliknande ), 1I5B9 (ixodegrin-2A RGD innehållande protein), 1I4G12 (okänd funktion), 1I3H6 (okänd funktion), 1I3F5 (ubiquitin) och 1I1H6 (GST) var signifikant olika mellan A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade ISE6-celler uppsamlade vid 3 dpi med cirka 40% infekterade celler (Figur 3). Förutom U2A8, 1I5B9, 1I4G12, C2E6, C4G3 och R4G5 som hade olika mRNA-nivåer i A. phagocytophilum-infekterade nymfer och fästing ISE6-celler (Figur 1), var mRNA-nivåerna för de studerade generna också olika mellan A. phagocytophilum-infekterad I. scapularis nymfer och A. marginal-infekterade fästingceller (data visas inte).

Eftersom kinetiken för differentiellt uttryckta gener kan variera med Anaplasma infektionsnivåer jämfördes uttrycket av utvalda gener med realtids-RT-PCR i A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade ISE6-celler uppsamlade vid 2, 5 och 8 dpi (Figur 4(a)). Resultaten visade tidsberoende variation i mRNA-förhållandena för studerade gener mellan A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade celler (Figur 4(b)). Däremot observerades signifikanta skillnader mellan A. phagocytophilum och A. marginal infektion vid alla tidpunkter, vilket tyder på att skillnader i genuttrycksprofiler framkallade av dessa patogener är närvarande under hela infektionscykeln i fästing ISE6-celler.

Jämförelse mellan differentiellt genuttryck i A. phagocytophilum- och A. marginal-infekterade fästing ISE6-celler vid olika tidpunkter efter infektion. Studier gjordes på A. phagocytophilum- (A.p.-) och A. marginal- (Am-)infekterade fästing ISE6-celler (två oberoende kulturer vardera) 2, 5 och 8 dagar efter infektion (dpi) med cirka 30 %� %, 60 %� % och 㺐 % infekterade celler , respektive. (a) A.p. och A.m. infektionsnivåer utvärderades genom realtids-PCR av msp4 och normaliserades mot fästing 16S rDNA. Kända mängder av full längd A.p. och A.m. msp4 PCR-produkt användes för att konstruera en standardkurva för kvantifiering av patogener per cell. Data representerar genomsnittlig ± SD. (b) mRNA-nivåerna för utvalda gener utvärderades med realtids-RT-PCR och normaliserades mot fästing 16S rRNA. Staplar representerar förhållandet mellan genomsnittliga Ct-värden i A.p.-infekterade celler/genomsnittliga Ct-värden i A.m.-infekterade celler. mRNA-nivåerna jämfördes mellan A.p.- och A.m.-infekterade fästingceller av Student's t-test (*P ≤ .05). Identiska mRNA-nivåer i A. phagocytophilum och A. marginal infekterade celler är lika med en.


RESULTAT

Mångfaldsprovtagning:

Sex av våra 7 accessioner ingår i en uppsättning av 96 Arabidopsis-accessioner från vilka 875 loci har sekvenserats (N ordborg et al. 2005) (walnut.usc.edu/2010/), vilket gör att vi kan uppskatta mängden artövergripande DNA-polymorfism som finns i vårt urval av accessioner. Vi identifierade polymorfismerna som fanns i 875 loci fördelade över genomet och poängsatte frekvensen av varje polymorfism bland de 96 accessionerna och om den polymorfismen var variabel i våra 6 accessioner. Våra 6 accessioner innehöll ~80% av de artövergripande medium- till högfrekventa polymorfismerna (mindre allelfrekvens >10%) (Figur 1). I den sällsynta till lågfrekventa klassen innehöll våra accessioner endast 20–30 % av arternas mångfald (Figur 1). Därför var våra anslutningar representativa för det mesta av medel- till högfrekvent sekvensvariation i Arabidopsis.

Provtagning av artvariation. Andelen polymorfismer i 96 Arabidopsis-accessioner som är polymorfa i de sex accessioner som är gemensamma med denna datamängd (Col-0, Cvi-1, Kin-0, Mt-0, Tsu-1 och Van-0) visas ( N ordborg et al. 2005). Allelerna arkiveras på basis av den mindre allelprocenten i datauppsättningen med 96 accessor (visas på x-axel). Den jämna linjen representerar den förväntade slumpmässiga urvalsfördelningen för 6 accessioner för varje allelprocentklass.

ANOVA av mikroarraydata för differentiellt uttryckta gener:

Den split-plot ANOVA avslöjade att fyra effekter var signifikanta för alla 21 par av accessioner: array, gen, interaktion av gen med accession och gen med tidpunkt (data visas inte och tabell 1). Eftersom uttrycksnivåerna varierar mellan olika gener förväntades en signifikant geneffekt. Den signifikanta genen × accessionsinteraktionseffekten indikerar att genuttrycket uppförde sig annorlunda i de olika accessionerna. Eftersom dessa skillnader kan bero på potentiella ELP:er eller sekvenspolymorfismer, kan den statistiska analysen inte skilja mellan dessa två alternativ. En signifikant gen × tidpunktsinteraktionseffekt indikerar att olika gener uppvisar distinkta uttrycksmönster över tiden. Den betydande arrayeffekten visar att det finns chip-till-chip-variation, men split-plot-modellen tog korrekt hänsyn till denna variationskälla. Under de 21 paren av accessioner fanns det inga signifikanta effekter för SA-behandling, interaktion av accession × behandling och accession × behandling × gen (trevägsinteraktion), vilket tyder på att SA-behandlingen inte starkt påverkade de övergripande uttrycksnivåerna över alla 22 810 gener, vilket förväntas med tanke på att endast en undergrupp av gener induceras av SA. Men regleringen av uttryck över tid påverkades definitivt av SA-behandling, vilket framgår av signifikanta effekter för tidpunkter och alla tidsrelaterade interaktioner.

ANOVA av parvisa uttrycksskillnader

Den parvisa ANOVA identifierade i genomsnitt 2234 gener som uppvisade differentiell expressionssignal (potentiella ELP) mellan två valfria accessioner över behandlingar, med användning av falsk upptäcktshastighet (FDR) multiple-testing correction (B enjamini och H ochberg 1995) och 331 gener när man använde Holms multipla provningskorrigering (H olm 1979) (Figur 2). Accession Cvi-1 hade fler potentiella ELP:er i alla sina parvisa jämförelser än någon av de andra accessionerna (Figur 2). För att bedöma variabiliteten hos potentiella ELP: er lade vi till antalet parvisa jämförelser för vilka en given gen visade en differentiell uttryckssignal. Den resulterande fördelningen var kraftigt svansad och sned mot låg till måttlig frekvens ELPs och var liknande för genlistor erhållna med antingen FDR eller Holms procedur (Figur 3). Intressant nog visade flera hundra gener differentiella uttryckssignaler i över hälften av de parvisa testerna, vilket tyder på att dessa gener har flera alleler som kan ge distinkta uttrycksnivåer.

Differentiellt genuttryck per par av accessioner. Antalet gener som visar differentiellt uttryck per accessionspar visas. Vänster y-axel och staplar visar antalet gener som visar polymorft uttryck, bestämt av ett signifikant H01 (differentiellt uttryckt mellan två accessioner), med signifikans bestämd av Holms test (se material och metoder för detaljer). Den rätta y-axis och diamanter visar antalet gener med uttryckspolymorfismer som uppfyller H01 med den signifikansnivå som bestäms av FDR-testet. Tillträdesparet är listat på x-axel: C, Col-0 I, Cvi-1 E, Est K, Kin-0 M, Mt-0 T, Tsu-1 och V, Van-0. Avg är genomsnittet för alla parvisa jämförelser.

Frekvensen av parvisa accessionsgenexpressionsskillnader. Den horisontella axeln indikerar antalet accessionspar (n = 21 par) för vilka generna detekteras som differentiellt uttryckta. Heldragna staplar anger antalet gener som identifierats med Holms procedur. Öppna staplar anger antalet gener som identifierats med FDR-proceduren.

Vi inkluderade en SA-behandling eftersom vi är intresserade av den naturliga variationen i svar på SA-ansökan. Användningen av två behandlingar (SA och kontroll) gav en möjlighet att undersöka konsekvenserna av experimentell behandlingsvariation på uppsättningen gener som visar differentiellt uttryck. SA är en viktig signalmolekyl involverad i växtförsvarssvar (G affney et al. 1993 D elaney et al. 1995). Vi använde en 0,30 m m SA-behandling, eftersom högre SA-nivåer orsakade fytotoxicitet i vissa accessioner (data visas inte). Statistisk analys identifierade i genomsnitt 660 gener med FDR och 25 gener med Holms procedur som visade differentiellt SA-svar mellan minst ett par accessioner. Dessa siffror representerar ~10–20% av generna som visar en skillnad i uttryck bland accessioner som inte uppvisade en behandlingsinteraktion. Detta tyder på att det finns avsevärd variation i svar på denna nyckelsignalmolekyl, men hur detta relaterar till variation i sjukdomsresistens är för närvarande okänt.

Kontrollgener:

För att testa förmågan hos vår ANOVA att detektera gener som tidigare rapporterats som varierande mellan accessioner, studerade vi en uppsättning gener som var kända för att visa naturlig variation i DNA-sekvens, mRNA-ackumulering och fenotyp. Denna jämförelse inkluderade gener involverade i produktionen av växtförsvarsrelaterade glukosinolater (ESP, AOP2, AOP3, GS-OH, Mam1, och MamL) (K liebenstein et al. 2001 L ambrix et al. 2001 K roymann et al. 2003), blomningstid (FLC, FRI, FLM, och HUA2) (Johanson et al. 2000 C aicedo et al. 2004 D oyle et al. 2005 L empe et al. 2005 W erner et al. 2005), hypokotylljussvar (PHYA och CRY2) (E l-A ssal et al. 2001 M avsides et al. 2001), och framkallande av motstånd (RPM1, RPS2, RPS4, RPS5, och RPP5) (G rant et al. 1995 P arker et al. 1997 G assmann et al. 1999 H enk et al. 1999 M auricio et al. 2003). Dessa gener klassificerades på basis av naturen hos de molekylära polymorfismerna (tabell 2). Varje polymorfism (INDEL, splitsningsplatspolymorfism eller observerad mRNA-skillnad) som kan orsaka en förändring i observerat genuttryck listades som en potentiell ELP. Vår statistiska analys identifierade 12 av de 13 gener som tidigare känts eller förutspåtts som differentiellt uttryckta (tabell 2). En gen (FLM) som vi inte identifierade som polymorf har en INDEL i en anslutning som inte ingick i vår studie (W erner et al. 2005). Gener med nonsens- eller missensepolymorfismer fungerade som kontroller och, som förväntat, detekterades inte som differentiellt uttryckta. Dessa resultat tyder på att vårt experiment har en låg falsk negativ frekvens för att detektera ELP.

Identifiering av kända gener med förväntad variation i uttryck mellan accessioner

För att kontrollera om ovanstående analys var partisk genom att använda gener som är kända för att orsaka fenotypiska polymorfismer, använde vi de 12 generna som visade differentiellt uttryck i de sju accessionerna för QRT-PCR-analys för differentiellt genuttryck. Den genomsnittliga korrelationen för uttrycksvärdena för dessa 12 gener mellan QRT-PCR- och ATH1 GeneChip-värden var 0,69, vilket indikerar att mikroarrayanalysen exakt detekterar gener med ELP.

SFP:er och differentiellt uttryck:

För att testa om närvaron av SFP:er signifikant förändrar uppskattningar av genuttryck, beräknade vi de skenbara uttrycksnivåerna för 400 gener som innehöll SFP:er mellan Col-0 och Cvi-1 med och utan signal från de SFP-innehållande sonderna och använde en split-split -plot ANOVA. Av de 400 SFP-innehållande generna var SFP ansvarig för ~0,13% av variansen i signal mellan dessa gener. Dessutom ledde inkludering av proberna med SFP:er i uppskattningen av en gens uttrycksvärde till endast en 7% minskning av uppskattningen. Därför är SFP inte en signifikant källa till variation i uppskattningar av genuttryck och skillnaderna mellan accessioner berodde främst på faktiska ELP:er.

Genfunktionsbias:

Tidigare arbete hade föreslagit en fördom i den funktionella klassificeringen av gener som visar differentiellt uttryck bland Arabidopsis-accessioner (C hen et al. 2005). När de biologiska GO-anteckningarna användes för att klassificera generna, berikades de differentiellt uttryckta generna signifikant för gener klassificerade som kontrollerande biotiska och abiotiska svar, stressresponser och signaltransduktion (Figur 4). Dessa skillnader i klassificeringsfrekvenser var signifikanta genom χ 2 -test i alla parvisa jämförelser per kategori såväl som för genomsnittet av de parvisa jämförelserna efter justering för flera jämförelser med Bonferroni-korrigering (data visas inte). Dessutom fanns det en signifikant minskning av gener klassificerade som involverade i transport (Figur 4). Detta resultat liknade de som tidigare rapporterats av C hen et al. (2005). En liknande jämförelse med GO-molekylära annoteringar identifierade en signifikant skillnad från hela genomförväntningen (i över hälften av de parvisa jämförelserna) endast för gener klassificerade som receptorbindning eller aktivitet. Inga klasser i GO cellulära kommentarer var signifikanta i de parvisa jämförelserna (data visas inte).

GO biologisk anteckningsjämförelse för differentiellt uttryckta gener. Fyllda staplar visar procentandelen av totala anteckningar i varje GO biologisk anteckningsklassificering med det fullständigt sekvenserade Arabidopsis-genomet från Col-0. Skuggade staplar (med standardfel) visar den genomsnittliga procentandelen av totala anteckningar för var och en av ovanstående biologiska GO-klassificeringar med alla 21 jämförelser mellan par av accessioner. Asterisker indikerar de klassificeringar som skiljer sig väsentligt från analysen av hela genomet som bestäms av χ 2 -test, med Bonferroni-korrigering. GO biologiska klassificeringar som beskriver okända proteiner inkluderades inte (dvs., andra fysiologiska processer, andra metaboliska processer, andra cellulära processer och biologiska processer okända) eftersom de var oinformativa.

Förhållandet mellan parvisa uttrycksskillnader och sekvensdivergens:

Om det inte finns någon större filtreringsmekanism, såsom differentiella selektionstryck på sekvens- och uttryckspolymorfismer eller massiva trans-verkande effekter, för att påverka effekten av DNA-sekvensvariation på genuttrycksvariation, förväntas ett genomomfattande förhållande mellan DNA-sekvensvariation och ELP-variation. För att bedöma detta samband bestämde vi den parvisa π, genomsnittliga parvisa nukleotiddivergensen (T ajima 1983 N ei 1987) mellan de sex accessioner för vilka det fanns sekvensdata, och jämförde sedan π med antalet gener vi upptäckt som differentiellt uttryckta mellan samma accessionspar (som bestäms av FDR). Det fanns ett signifikant positivt samband mellan dessa värden (Figur 5). Denna linjära regressionsanalys svarade för om paret inkluderade Col-0, från vilken oligomerproberna på ATH1 GeneChip designades (N = 15, P < 0,0001, r = 0,83 Col-0 närvaro i accessionspar, d.f. = 1, P = 0,0483) (Figur 5). Uppskattningarna av genuttrycksdivergens som tillhandahålls av Holms multipla testkorrigering genererade ett nästan identiskt förhållande mellan sekvens och genuttrycksdivergens (N = 15, P < 0,0001, r = 0,86 Col-0 närvaro i accessionspar, d.f. = 1, P = 0,0097). Denna association var också signifikant när man jämförde π mot antalet gener som visar en uttrycksskillnad beroende på en accession × behandlingsinteraktion (N = 15, P < 0,0001, r = 0,95 Col-0 närvaro i accessionspar, d.f. = 1, P = 0,001). Dessa gener hade sannolikt inte påverkats av hybridiseringsskillnader, såsom de som orsakas av INDEL-polymorfismer, eftersom dessa gener uppvisade icke-variabel genuttryck i en behandling över två accessioner men visade differentiell genuttryck under den andra behandlingen. Detta förhållande mellan π och generna som är betydelsefulla för anslutning × behandlingsinteraktioner stöder ytterligare hypotesen att SFP:er inte signifikant påverkade uppskattningar av genuttrycksvariation och att vi verkligen mätte ELP:er bland accessioner.

Sekvensdivergens och genuttrycksskillnader är associerade. Förhållandet mellan π och antalet ELP mellan par av sex accessioner (Col-0, Cvi-1, Kin-0, Mt-0, Tsu-1 och Van-0), bestämt av linjär regression och FDR-genlista (n = 15, P < 0,001, r 2 = 0,83), visas. Parvisa jämförelser som innehåller Col-0 visas som öppna cirklar heldragna cirklar anger par som inte inkluderar Col-0. Ett liknande linjärt samband identifierades med Holms genlista (n = 15, P < 0,001, r = 0.80).

Genomisk fördelning av uttrycksskillnader och sekvensdivergens:

Förhållandet mellan π och genuttrycksvariation (föregående avsnitt) är en genomomfattande genomsnittlig jämförelse. För att bedöma om det fanns ett samband mellan lokal DNA-sekvensvariation och genuttrycksvariation genomförde vi en skjutfönsteranalys längs Arabidopsis-kromosomerna (Figur 6). Ett distinkt förhållande i lokal sekvensvariation och genuttrycksvariation upptäcktes, eftersom de två spåren var mycket lika över kromosomerna (Figur 6). Lokala toppar av DNA-sekvensavvikelser bland accessioner som typiskt samlokaliseras med lokala anrikningar i antalet gener som visar polymorft genuttryck. I synnerhet finns det en region nära mitten av kromosom III som har en signifikant ökning av genuttryckspolymorfism och som också är berikad i DNA-sekvensvariation (Figur 6). Två regioner med brist på lokal korrelation mellan sekvensdiversitet och polymorft genuttryck kan förklaras av tekniska eller biologiska skäl.Den platta regionen för differentiellt genuttryck på toppen av kromosom IV är ett område med låg gentäthet på grund av närvaron av den nukleolära organiserande regionen. Den ~10-Mbp regionen på kromosom V som hade låga uppskattningar av π har också en brist på sekvenserade loci och kan representera en lokal provtagningsbias.

Lokal kromosomal association mellan nukleotid och differentiell genuttrycksvariation. Jämförelse i skjutfönster av nukleotidvariation (π) mot. differentiellt genuttryck i de 6 accessionerna (Col-0, Cvi-1, Kin-0, Mt-0, Tsu-1 och Van-0) gemensamt med de 96 accessionerna från sekvensdatabasen visas (N ordborg et al. 2005). Den svarta linjen är det genomsnittliga antalet ELPs per lokus uppmätt i ett 500-genomfattande skjutfönster. De x-axeln för varje graf är i megabaspar som markerats. De horisontella linjerna representerar P = 0,05 trösklar för det differentiellt uttryckta glidande fönstret som erhållits via permutationsanalysen (0,056 är P = 0,05 minimum och 0,132 är P = maximalt 0,05). Den grå linjen representerar en 5-Mbp skjutfönsteranalys av genomsnittlig π per loci.


Jämföra genuttrycksnivåer mellan kontroll och sjukdom vid olika tidpunkter - Biologi

För att förstå hur genuttryck regleras måste vi först förstå hur en gen kodar för ett funktionellt protein i en cell. Processen sker i både prokaryota och eukaryota celler, bara på något olika sätt.

Prokaryota organismer är encelliga organismer som saknar cellkärna och deras DNA flyter därför fritt i cellcytoplasman. För att syntetisera ett protein sker processerna för transkription och translation nästan samtidigt. När det resulterande proteinet inte längre behövs stoppas transkriptionen. Som ett resultat är den primära metoden för att kontrollera vilken typ av protein och hur mycket av varje protein som uttrycks i en prokaryotisk cell regleringen av DNA-transkription. Alla efterföljande steg sker automatiskt. När mer protein krävs sker mer transkription. Därför, i prokaryota celler, är kontrollen av genuttryck mestadels på transkriptionsnivå.

Eukaryota celler har däremot intracellulära organeller som ökar deras komplexitet. I eukaryota celler finns DNA inuti cellens kärna och där transkriberas det till RNA. Det nysyntetiserade RNA:t transporteras sedan ut ur kärnan till cytoplasman, där ribosomer översätter RNA:t till protein. Processerna för transkription och translation är fysiskt åtskilda av kärnmembranet transkription sker endast inom kärnan, och translation sker endast utanför kärnan i cytoplasman. Regleringen av genuttryck kan ske i alla stadier av processen (Figur 1). Reglering kan ske när DNA lindas upp och lossas från nukleosomer för att binda transkriptionsfaktorer (epigenetisk nivå), när RNA:t transkriberas (transkriptionsnivå), när RNA:t bearbetas och exporteras till cytoplasman efter att det har transkriberats (post-transkriptionell nivå), när RNA:t översätts till protein (translationsnivå), eller efter att proteinet har gjorts (efter översättning nivå).

Figur 1. Prokaryotisk transkription och translation sker samtidigt i cytoplasman, och reglering sker på transkriptionsnivå. Eukaryot genuttryck regleras under transkription och RNA-bearbetning, som sker i kärnan, och under proteintranslation, som sker i cytoplasman. Ytterligare reglering kan ske genom posttranslationella modifieringar av proteiner.

Skillnaderna i regleringen av genuttryck mellan prokaryoter och eukaryoter sammanfattas i tabell 1. Regleringen av genuttryck diskuteras i detalj i efterföljande moduler.

Tabell 1. Skillnader i regleringen av genuttryck av prokaryota och eukaryota organismer
Prokaryota organismer Eukaryota organismer
Saknar kärna Innehåller kärna
DNA finns i cytoplasman DNA är begränsat till det nukleära utrymmet
RNA-transkription och proteinbildning sker nästan samtidigt RNA-transkription sker före proteinbildning och den äger rum i kärnan. Översättning av RNA till protein sker i cytoplasman.
Genuttryck regleras primärt på transkriptionsnivå Genuttryck regleras på många nivåer (epigenetisk, transkriptionell, nukleär shuttling, post-transkriptionell, translationell och posttranslationell)

Utveckling av genreglering

Prokaryota celler kan bara reglera genuttryck genom att kontrollera mängden transkription. När eukaryota celler utvecklades ökade komplexiteten i kontrollen av genuttryck. Till exempel, med utvecklingen av eukaryota celler kom kompartmentalisering av viktiga cellulära komponenter och cellulära processer. En kärnregion som innehåller DNA bildades. Transkription och translation separerades fysiskt i två olika cellulära fack. Det blev därför möjligt att kontrollera genuttrycket genom att reglera transkriptionen i kärnan, och även genom att kontrollera RNA-nivåerna och proteintranslationen som finns utanför kärnan.

Vissa cellulära processer uppstod från organismens behov att försvara sig. Cellulära processer såsom gentystnad utvecklades för att skydda cellen från virus- eller parasitinfektioner. Om cellen snabbt kunde stänga av genuttryck under en kort tid skulle den kunna överleva en infektion när andra organismer inte kunde. Därför utvecklade organismen en ny process som hjälpte den att överleva, och den kunde överföra denna nya utveckling till avkomman.


Titta på videon: . Merkitsevät numerot ja pyöristyssäännöt (Augusti 2022).