Information

Eukaryot DNA-polymeras i Leading and Lagging Strand

Eukaryot DNA-polymeras i Leading and Lagging Strand



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Olika böcker säger olika specifikationer om vilket eukaryot DNA-polymeras som fungerar i ledande sträng och vilket DNA-polymeras som fungerar i eftersläpande sträng.

TL,DR: Vilken är verkligheten? och om det finns flera möjligheter, vilken är då tillämplig för vilken organism (såsom mänskliga däggdjur, jästsvamp, Arabidopsis växt etc.)?

Mycket varierande information som t.ex.

Enligt boken The Cell av G.M. Cooper (NCBI), i däggdjurs eukaryota system, DNA-polymeras δ fungerar i både ledande och eftersläpande sträng.

Enligt boken Molecular biology av R. F. Weaver, ed-5; DNA pol-δ fungerar i eftersläpande sträng och pol ε fungerar i eftersläpande sträng och DNA pol ε fungerar i ledande sträng.

Grunderna för molekylärbiologi, Lizabeth Allison (Semantic Scholar) säger en annan sak, den säger att pol ε fungerar på eftersläpande sträng.

Uppsatsen av Stillman B., DNA-polymeraser vid replikationsgaffeln i eukaryoter. (NCBI) (NCBI-PMC) (FIGUR) säger i SV40 viral modell att δ-polymeraset fungerar i båda strängarna men i cellkromosomen, δ fungerar på lagging och &epsilon fungerar i ledande sträng.

Vilken är nu sann? om alla är sanna är de då tillämpliga på olika organismer?


  • Under initiering binder proteiner till replikationsursprunget medan helikas lindar upp DNA-helixen och två replikationsgafflar bildas vid replikationsursprunget.
  • Under förlängning tillsätts en primersekvens med komplementära RNA-nukleotider, som sedan ersätts av DNA-nukleotider.
  • Under förlängning görs den ledande strängen kontinuerligt, medan den eftersläpande strängen görs i bitar som kallas Okazaki-fragment.
  • Under avslutningen avlägsnas primrar och ersätts med nya DNA-nukleotider och ryggraden förseglas med DNA-ligas.
  • ursprunget för replikation: en speciell sekvens i ett genom vid vilken replikation initieras
  • Ledande sträng: mallsträngen av DNA-dubbelhelixen som är orienterad så att replikationsgaffeln rör sig längs den i riktningen 3&prime till 5&prime
  • eftersläpande strand: strängen av mall-DNA-dubbelhelixen som är orienterad så att replikationsgaffeln rör sig längs den på ett 5&prime till 3&prime sätt

Eftersom eukaryota genom är ganska komplexa är DNA-replikation en mycket komplicerad process som involverar flera enzymer och andra proteiner. Det sker i tre huvudstadier: initiering, förlängning och avslutning.


Arrangera eukaryota nukleära DNA-polymeraser för replikering: Specifika interaktioner med accessoriska proteiner arrangerar Pols α, δ och ϵ i replisomen för replikering av ledande sträng och eftersläpande sträng DNA.

Biokemiska och kryo-elektronmikroskopistudier har just publicerats som avslöjar interaktioner mellan proteiner i jästreplisomen som är viktiga för en mycket koordinerad syntes av de två DNA-strängarna i kärngenomet. Dessa studier avslöjar nyckelinteraktioner som är viktiga för att arrangera DNA-polymeraser α, δ och ϵ för replikering av ledande och eftersläpande strängar. CMG (Mcm2-7, Cdc45, GINS) helikasen är central i detta interaktionsnätverk. Det här är bara de senaste exemplen på eleganta studier utförda i det senaste förflutna som leder till en mycket bättre förståelse för hur den eukaryota replikationsgaffeln uppnår effektiv DNA-replikation som är tillräckligt noggrann för att förhindra sjukdomar men ändå tillåter evolution.

Nyckelord: DNA-polymeraser DNA-replikation kryo-elektronmikroskopi initiering av replikationsreplisom.

Den här artikeln har bidragit till av amerikanska regeringsanställda och deras arbete är allmän egendom i USA.


Biologi 171

I slutet av det här avsnittet kommer du att kunna göra följande:

  • Diskutera likheter och skillnader mellan DNA-replikation i eukaryoter och prokaryoter
  • Ange telomerasets roll i DNA-replikation

Eukaryota genom är mycket mer komplexa och större i storlek än prokaryota genom. Eukaryoter har också ett antal olika linjära kromosomer. Det mänskliga genomet har 3 miljarder baspar per haploida uppsättning kromosomer, och 6 miljarder baspar replikeras under S-fasen av cellcykeln. Det finns flera replikationsursprung på varje eukaryotisk kromosom som människor kan ha upp till 100 000 replikationsursprung över genomet. Replikationshastigheten är ungefär 100 nukleotider per sekund, mycket långsammare än prokaryotisk replikation. I jäst, som är en eukaryot, finns speciella sekvenser kända som autonomt replikerande sekvenser (ARS) på kromosomerna. Dessa är ekvivalenta med ursprunget för replikering i E coli.

Antalet DNA-polymeraser i eukaryoter är mycket fler än i prokaryoter: 14 är kända, varav fem är kända för att ha stora roller under replikering och har studerats väl. De är kända som pol α, pol β, pol γ, pol δ, och pol ε.

De väsentliga stegen för replikering är desamma som i prokaryoter. Innan replikeringen kan starta måste DNA:t göras tillgängligt som en mall. Eukaryot DNA är bundet till grundläggande proteiner som kallas histoner för att bilda strukturer som kallas nukleosomer. Histoner måste avlägsnas och sedan ersättas under replikeringsprocessen, vilket hjälper till att förklara den lägre replikeringshastigheten i eukaryoter. Kromatinet (komplexet mellan DNA och proteiner) kan genomgå vissa kemiska modifieringar, så att DNA:t kan glida av proteinerna eller vara tillgängligt för enzymerna i DNA-replikationsmaskineriet. Vid replikationsursprunget görs ett prereplikationskomplex med andra initiatorproteiner. Helicase och andra proteiner rekryteras sedan för att starta replikeringsprocessen ((Figur)).

Skillnaden mellan prokaryotisk och eukaryotisk replikering
Fast egendom Prokaryoter Eukaryoter
Ursprung för replikering Enda Flera olika
Replikationshastighet 1000 nukleotider/s 50 till 100 nukleotider/s
DNA-polymerastyper 5 14
Telomeras Inte närvarande Närvarande
Avlägsnande av RNA-primer DNA pol I RNase H
Strandförlängning DNA pol III Pol a, pol 5, pol e
Glidklämma Glidklämma PCNA

En helikas som använder energin från ATP-hydrolys öppnar upp DNA-spiralen. Replikationsgafflar bildas vid varje replikationsursprung när DNA lindas upp. Öppningen av den dubbla helixen orsakar överlindning, eller supercoiling, i DNA:t framför replikationsgaffeln. Dessa löses med verkan av topoisomeraser. Primers bildas av enzymet primas och med hjälp av primern kan DNA pol starta syntesen. Tre stora DNA-polymeraser är då involverade: a, 5 och e. DNA pol α lägger till ett kort (20 till 30 nukleotider) DNA-fragment till RNA-primern på båda strängarna och skickar sedan vidare till ett andra polymeras. Medan den ledande strängen kontinuerligt syntetiseras av enzymet pol δ, syntetiseras den eftersläpande strängen av pol ε. Ett glidande klämprotein som kallas PCNA (proliferating cell nuclear antigen) håller DNA-polen på plats så att den inte glider av DNA:t. När pol δ löper in i primer-RNA:t på den eftersläpande strängen, förskjuter den den från DNA-mallen. Det undanträngda primer-RNA:t avlägsnas sedan med RNase H (AKA flik-endonukleas) och ersätts med DNA-nukleotider. Okazaki-fragmenten i den eftersläpande strängen sammanfogas efter ersättning av RNA-primrarna med DNA. De luckor som finns kvar tätas av DNA-ligas, som bildar fosfodiesterbindningen.

Telomer replikering

Till skillnad från prokaryota kromosomer är eukaryota kromosomer linjära. Som du har lärt dig kan enzymet DNA pol lägga till nukleotider endast i riktningen 5′ till 3′. I den ledande strängen fortsätter syntesen tills slutet av kromosomen nås. På den eftersläpande strängen syntetiseras DNA i korta sträckor, som var och en initieras av en separat primer. När replikationsgaffeln når änden av den linjära kromosomen, finns det inget sätt att ersätta primern på 5'-änden av den eftersläpande strängen. DNA:t i ändarna av kromosomen förblir alltså oparade, och med tiden kallas dessa ändar, telomerer, kan bli allt kortare när celler fortsätter att dela sig.

Telomerer innefattar repetitiva sekvenser som inte kodar för någon speciell gen. Hos människor upprepas en sex-basparssekvens, TTAGGG, 100 till 1000 gånger i telomerregionerna. På ett sätt skyddar dessa telomerer generna från att raderas när celler fortsätter att dela sig. Telomererna läggs till ändarna av kromosomerna av ett separat enzym, telomeras ((Figur)), vars upptäckt hjälpte till att förstå hur dessa repetitiva kromosomändar bibehålls. Telomerasenzymet innehåller en katalytisk del och en inbyggd RNA-mall. Den fäster vid änden av kromosomen, och DNA-nukleotider som är komplementära till RNA-mallen läggs till på 3′-änden av DNA-strängen. När 3′-änden av mallen med eftersläpande sträng är tillräckligt förlängd, kan DNA-polymeras lägga till nukleotiderna komplementära till ändarna av kromosomerna. Således replikeras ändarna av kromosomerna.


Telomeras är vanligtvis aktivt i könsceller och vuxna stamceller. Det är inte aktivt i vuxna somatiska celler. För sin upptäckt av telomeras och dess verkan fick Elizabeth Blackburn, Carol W. Greider och Jack W. Szostak ((Figur)) Nobelpriset i medicin och fysiologi 2009.


Telomeras och åldrande

Celler som genomgår celldelning fortsätter att få sina telomerer förkortade eftersom de flesta somatiska celler inte gör telomeras. Detta betyder i huvudsak att telomerförkortning är förknippad med åldrande. Med tillkomsten av modern medicin, förebyggande hälsovård och hälsosammare livsstilar har den mänskliga livslängden ökat, och det finns en ökande efterfrågan på att människor ska se yngre ut och få en bättre livskvalitet när de blir äldre.

År 2010 fann forskare att telomeras kan vända vissa åldersrelaterade tillstånd hos möss. Detta kan ha potential inom regenerativ medicin. 1 Möss med telomerasbrist användes i dessa studier. Dessa möss har vävnadsatrofi, utarmning av stamceller, organsystemsvikt och nedsatt vävnadsskadasvar. Telomerasreaktivering hos dessa möss orsakade förlängning av telomerer, minskad DNA-skada, omvänd neurodegeneration och förbättrade testiklarnas, mjältens och tarmarnas funktion. Således kan telomerreaktivering ha potential för behandling av åldersrelaterade sjukdomar hos människor.

Cancer kännetecknas av okontrollerad celldelning av onormala celler. Cellerna ackumulerar mutationer, förökar sig okontrollerat och kan migrera till olika delar av kroppen genom en process som kallas metastaser. Forskare har observerat att cancerceller har avsevärt förkortade telomerer och att telomeras är aktivt i dessa celler. Intressant nog, först efter att telomererna förkortats i cancercellerna blev telomeraset aktivt. Om verkan av telomeras i dessa celler kan hämmas av läkemedel under cancerterapi, kan cancercellerna potentiellt stoppas från ytterligare delning.

Avsnittssammanfattning

Replikation i eukaryoter börjar vid flera replikationsstartpunkter. Mekanismen är ganska lik den hos prokaryoter. En primer krävs för att initiera syntes, som sedan förlängs av DNA-polymeras när den lägger till nukleotider en efter en till den växande kedjan. Den ledande strängen syntetiseras kontinuerligt, medan den eftersläpande strängen syntetiseras i korta sträckor som kallas Okazaki-fragment. RNA-primrarna ersätts med DNA-nukleotider och DNA Okazaki-fragmenten är länkade till en kontinuerlig sträng med DNA-ligas. Ändarna av kromosomerna utgör ett problem eftersom primer-RNA vid 5'-ändarna av DNA:t inte kan ersättas med DNA, och kromosomen förkortas successivt. Telomeras, ett enzym med en inbyggd RNA-mall, förlänger ändarna genom att kopiera RNA-mallen och förlänga en sträng av kromosomen. DNA-polymeras kan sedan fylla i den komplementära DNA-strängen med hjälp av vanliga replikationsenzymer. På så sätt skyddas kromosomernas ändar.

Gratis svar

Hur säkerställer de linjära kromosomerna i eukaryoter att dess ändar replikeras fullständigt?

Telomeras har en inbyggd RNA-mall som förlänger 3′-änden, så primer syntetiseras och förlängs. Därmed är ändarna skyddade.

Fotnoter

    Jaskelioff et al., "Telomerasreaktivering vänder vävnadsdegeneration i åldrade möss med telomerasbrist," Natur 469 (2011): 102-7.

Ordlista


Skillnader mellan ledande och eftersläpande sträng

Vad är skillnaden mellan ledande sträng och eftersläpande sträng? DNA-polymerasenzymet syntetiserar en ny sträng i kontinuerligt stycke i 5′-3′ riktning och kallas ledande sträng, det kräver bara en primer för att initiera tillväxten och DNA-ligasenzym behövs inte och det bildades kontinuerligt som ett enda fragment. Men DNA-polymerasenzymet syntetiserar en ny sträng i ett diskontinuerligt stycke i 5′-3′ riktning och kallas eftersläpande sträng, i början bildas det i form av ett litet fragment som kallas okazaki-fragment, varje fragment kräver separat RNA-primer för att initiera och kräva DNA-ligasenzym för att förena alla fragment.

Skillnader mellan ledande och eftersläpande strand

Nu förklarar vi kort skillnaden mellan ledande och eftersläpande sträng genom att följa till punkten: -

Ledande sträng:-
1) den formas kontinuerligt i 5′-3′ riktning i ett enda fragment

2) det krävs bara en primer för att initiera tillväxten

3) DNA-ligasenzym krävs inte för denna sträng

4) tillväxtriktningen för den ledande delen är 5′-3′.

Eftersläpande strand:-
1) i början bildas det i form av ett litet fragment som kallas okazaki-fragment

2) varje fragment kräver separat RNA-primer för att initiera

3) det krävs DNA-ligasenzym för att förena DNA-fragment

4) av komplett sträng är den 3′-5′ i riktning men för okazaki-fragment är den i 5′-3′ riktning.


4. REPLIKATION AV LEDANDE STRAND

4.1. CMG DNA Helicase

Under de senaste åren har biokemiska studier av DNA-replikation visat stora framsteg. Under 2015 har den fullständiga rekonstitutionen av DNA-replikationsinitiering och förlängning rapporterats med renade proteiner från jäst (5). I det här avsnittet fokuserar vi på funktionen hos den ledande sträng-replikasen bestående av CMG-helikasen och Pol ε. Initiering av DNA-replikation är associerad med omarrangemanget av Mcm2-7 kärnhelikas från en inaktiv form som omger dsDNA till den av en aktiv helikas, som omsluter ssDNA och lindar upp parentalt dsDNA med hjälp av energin från adenosintrifosfat (ATP) hydrolys (Figur 1) . Flera bevis stödjer lokaliseringen av MCM-kärnan runt den ledande strängen. CMG-komplexet är associerat med den ledande delen Pol ε, vilket gör dess associering med den ledande delen rimlig (13, 14). CMG är ett 3′-5′ helikas på modell-DNA-substrat (20), liksom det homologa arkeala MCM-helikaset (68, 69). Denna riktning skulle placera komplexet på den främre strängen när den rör sig i gaffelns riktning. Vidare förbigås vägspärrar med eftersläpande strand, men inte vägspärrar av ledande sträng, av CMG-helikasen, vilket tyder på en tät association med den ledande strängen (70).

Även om strukturer för röntgen- och kryoelektronmikroskopi (cryo-EM) har funnits tillgängliga för var och en av de tre underenheterna av CMG under en tid (se referenser i 71, 72), har två spännande nya studier gett högupplösta kryo- EM-strukturer av CMG-komplexet. Båda studierna avslöjar ett liknande övergripande arrangemang av de tre underenheterna—Mcm2-7, Cdc45 och GINS—, vilket ger ny information om organisationen av den ledande strängreplikaten. Strukturen av jäst CMG erhölls utan DNA vid 3,7𠄴,8Å upplösning (73). Dessa kryo-EM-data överensstämmer med närvaron av två olika konformers, en kompakt form och en utökad form. Omvandlingen från den utökade till den kompakta formen vid ATP-bindning föreslås vara associerad med rörelse av de sex AAA+-domänerna i Mcm2-7-kärnan, även om hydrolys av ATP omvänder denna rörelse, vilket gör att CMG-helikasen kan röra sig längs ssDNA i en inchworm rörelse. En andra kryo-EM-struktur, av Drosophila CMG-komplex erhölls i närvaro av en delvis dsDNA-molekyl som efterliknar en stabil replikationsgaffel (74). Återigen erhölls två huvudkonformers, en kompakt form med 7,4 Å upplösning och en avslappnad form med 9,8 Å upplösning. I den kompakta formen kan ssDNA-delen av DNA:t visualiseras att träs genom Mcm2-7-ringen, vilket stöder slutsatserna från tidigare studier att CMG omger den ledande strängen. Den andra, avslappnade strukturen saknar DNA-densitet i kärnan och visar ett gap mellan underenheterna Mcm2 och Mcm5. Intressant nog föreslås att både den initiala laddningen av MCM-komplexet runt dsDNA och den efterföljande omvandlingen till den för en aktiv helikas som omger ssDNA förmedlas genom en öppning mellan Mcm2- och Mcm5-subenheterna (75, 76). Den kompakta formen av CMG dominerar i närvaro av icke-hydrolyserbart adenosin 5′-γ-tiotrifosfat (ATPγS), medan den avslappnade formen dominerar i närvaro av ATP. Den senare formen representerar sannolikt en struktur i vilken ATP har hydrolyserats, vilket stöder en modell där ATP-hydrolys skulle omvandla den kompakta formen till en avslappnad form. Intressant nog är denna konformationsförändring associerad med endast minimal sträckningsrörelse av CMG, vilket observerades med jäst-CMG och utgjorde grunden för en inchworm-modell för helikasverkan (73). Dessa nya strukturer av CMG-komplexet är bara början på en ny riktning för biofysiken för DNA-replikationsstudier med hjälp av kryo-EM-studier.

4.2. DNA-polymeras ε och ledande DNA-replikation

De tre replikativa DNA-polymeraserna, α, δ och ε, är medlemmar av B-familjen av DNA-polymeraser. En grundlig genomgång av dessa enzymer faller utanför omfattningen av denna recension, och läsaren hänvisas till nya omfattande recensioner som diskuterar både strukturen och funktionen hos Pol α, Pol δ och Pol ε och deras evolutionära relationer (77, 78). En annan nyligen genomförd recension beskriver konsekvensen av replikativa polymerasmutationer på cancerdisposition hos människor (79). I det här avsnittet överväger vi kortfattat egenskaperna som predisponerar dessa polymeraser för att replikera de två strängarna i kärngenomet (Figur 3).

Eukaryota DNA-replikaser. DNA-polymeras α (Pol α, röd ) och Pol ε ( grön) innehåller fyra underenheter, och Saccharomyces cerevisiae Pol δ (blå) innehåller tre underenheter, medan mänskliga Pol 㭊nd Schizosaccharomyces pombe Pol δhar ytterligare en liten fjärde underenhet (visas inte). Påvisade [4Fe𠄴S] järnsvavelkluster indikeras med stora orange kulor och bundna zinkatomer med små grå kulor. Katalytiska egenskaper och proteininteraktioner är listade. Observera att Pol δ har en hög trohet för bas�sfelmatchningar men lägre trohet för ennukleotiddeletioner i repetitiva sekvenser. Förkortningar: GINS, Sld5, Psf1, Psf2 och Psf3 komplex n.d., ej bestämd PCNA, prolifererande cellkärnantigen.

Fastigheterna hos Pol ε skiljer sig från Pol α och Pol δ på flera sätt. Pol ε har en högmolekylär subenhet vars N-terminala domän kodar för DNA-polymerisation och 3′-exonukleolytisk aktivitet och en homolog men katalytiskt inaktiv C-terminal domän (CTD) som krävs för replisommontering och kontrollpunktsaktivering (55�, 80, 81). Holoenzymformen av Pol ε innehåller också en icke-katalytisk Dpb2-subenhet som är väsentlig och Dpb3- och Dpb4-subenheter som är icke-essentiella (82). Närvaron av en liten domän i den katalytiska subenheten tillåter Pol ε att omsluta det begynnande dsDNA (83), vilket sannolikt är ansvarigt för detta enzyms höga inre processivitet. Denna höga processivitet ökas ytterligare av de icke-essentiella Dpb3- och Dpb4-subenheterna och genom interaktioner med replikationsklämman PCNA. Däremot förstärks den mycket låga inre processiviteten för DNA-syntes av Pol δ avsevärt av PCNA, så att i närvaro av PCNA både Pol ε och Pol δ har jämförbar processivitet (84).

Kapaciteten för strängförskjutningssyntes av det eftersläpande DNA-polymeraset är väsentlig för effektiv mognad av Okazaki-fragment på den eftersläpande strängen. Jämfört med Pol δ, Pol ε utför inte effektiv strängförskjutningssyntes (85). Till stor del är detta en konsekvens av dess mycket aktiva 3′-exonukleasaktivitet, eftersom strängförskjutningssyntes kan observeras i det exonukleasdefekta enzymet (86). Den inneboende 3′-exonukleasaktiviteten hos Pol ε korrekturläser sina egna replikeringsfel (87), och den gör detta så effektivt att Pol ε syntetiserar DNA mer exakt än den korrekturläsande Pol δ och mycket mer exakt än den korrekturläsande Pol α. Lyckligtvis uppvägs denna lägre trohet på den eftersläpande strängen av en mer aktiv felanpassningsreparation på den strängen (64). Sålunda gör bristen på strängförskjutningskapacitet Pol ε mindre lämplig att fungera som den eftersläpande strängen replikas. Däremot orsakar dess interaktioner med flera komponenter i CMG-komplexet dess unika inriktning mot replikationsgaffelns ledande sträng (Figur 3). Tidigare biokemiska och genetiska studier etablerade en väsentlig interaktion mellan Dpb2-subenheten av Pol ε och Psfl-subenheten av GINS (14). En lågupplöst cryo-EM-studie av CMG-helikasen i ett komplex med Pol ε överensstämmer med dessa interaktioner, och denna struktur avslöjade ytterligare interaktioner mellan Mcm5 och den C-terminala halvan av Pol2 (88). Den funktionella betydelsen av dessa interaktioner med Pol ε stöds av färska biokemiska studier av O𠆝onnell och medarbetare (89, 90). CMG-helikasen, förladdad på den ledande delen av en modellreplikeringsgaffel, rekryterade Pol ε till den ledande delen framför Pol δ och på ett sätt som var beroende av Pol ε’s Dpb2-underenhet. Dessutom, även när Pol δ var förbunden med den ledande delen, Pol ε förträngde det lätt om CMG-komplex fanns närvarande.

Cryo-EM-strukturen för CMG–Pol ε komplex avslöjade inte bara dess övergripande arkitektur och proteininteraktioner utan föreslog också en väg för att trä det ledande ssDNA genom CMG-komplexet och Pol ε (88) (Figur 4). I tidigare biokemiska studier i Xenopus äggextraktbaserat DNA-replikationssystem fick replikationsgaffeln springa in i en exakt placerad tvärbindning mellan strängarna (91). Övergående stopp av replikering av ledande sträng observerades

40 nt före tvärbindningen, följt av ett mer uttalat stopp vid en position

20 nt före tvärbindningen. De

20-nt stall överensstämmer med längden av DNA som är tilltäppt av Mcm2-7 hexameren (74), medan

40-nt stall föreslås representera ytterligare gängning av den ledande strängen genom Cdc45 och GINS innan den går in i Pol ε aktiv plats (88). Dessa biokemiska och strukturella överväganden skulle tyda på att den ledande strängen företrädesvis träs genom hela CMG-komplexet innan den binder Pol ε, men det kan ha flexibiliteten att enkelt frigöras från Cdc45–GINS, kanske för att möjliggöra ett mer flexibelt svar på utmaningar i ledande DNA-replikation (Figur 4).

Replisome struktur och interaktioner. Två modeller för vägen som den ledande strängen tar innan den går in i DNA-polymeraset ε (Pol ε) katalytisk plats. Antingen (a)

20-nts längder av enkelsträngat DNA tilltäpps. Förslaget har lagts fram att även dessa två former kan interkonvertera. Den eftersläpande strängen visas slingad så att både Pol α och Pol ε rör dig i samma riktning medan du hålls i ett komplex av Ctf4. Förkortningar: GINS, Sld5, Psf1, Psf2 och Psf3 komplex Mcm2-7, helikaskomplex PCNA, prolifererande cellkärnantigen RPA, replikationsprotein A.


DNA-polymeraser

Enzymer som katalyserar DNA-syntes på en DNA-mall är DNA-polymeraser. De utför två primära funktioner i cellen: syntesen av DNA under genomreplikering och återsyntesen av saknat DNA efter skada av rekombination och efter primerexcision från den eftersläpande strängen.

I både prokaryoter och eukaryoter är specialiserade DNA-polymeraser dedikerade till replikations- och reparationsfunktioner, de förra kallas ibland DNA-replikaser. Alla DNA-polymeraser har en 5′->3′ polymeras aktivitet. och pyrofosforolys aktivitet, vilket tillsammans underlättar DNA-syntes.


Mekanism för asymmetrisk polymerasmontering vid den eukaryota replikationsgaffeln

Eukaryoter använder distinkta polymeraser för replikering av ledande och eftersläpande strängar, men hur de riktar in sig på sina respektive strängar är osäkert. Vi rekonstituerade Saccharomyces cerevisiae replikationsgafflar och fann att CMG-helikas väljer polymeras (Pol) ɛ med uteslutande av Pol δ på den ledande strängen. Även om Pol δ sätts ihop på den ledande strängen, ersätter Pol ɛ den snabbt. Pol δ-PCNA är distributiv med CMG, i motsats till dess höga stabilitet på primat ssDNA. Därför kommer CMG inte att stabilisera Pol δ, utan istället lämna den ledande strängen tillgänglig för Pol ɛ och stabilisera Pol ɛ. Jämförelse av Pol ɛ och Pol δ på en eftersläpande strängmodell-DNA avslöjar motsatsen. Pol δ dominerar över överskott av Pol ɛ på PCNA-primat ssDNA. Således gynnar PCNA starkt Pol δ framför Pol ɛ på den eftersläpande strängen, men CMG åsidosätter och vänder denna balans till förmån för Pol ɛ på den ledande strängen.

Uttalande av intressekonflikt

KONKURRANDE FINANSIELLA INTRESSEN

Författarna deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Siffror

Rekonstitution av en replisom med ledande sträng...

Rekonstitution av en replisom med ledande sträng med CMG, Pol ε, RFC, PCNA och RPA.…

Jämförelse av Pol ε och Pol δ i replikering av ledande strängar med CMG. Tid…

CMG väljer Pol ε från en blandning av Pol ε och Pol δ.…

Pol ε fungerar stabilt med...

Pol ε fungerar stabilt med CMG, medan Pol δ inte gör det. ( en …

Pol ε och Pol δ associeras snabbt med en PCNA-primad mall. ( en …

Pol δ är dominant över Pol ε på en modellmall med eftersläpande sträng. (…

Schema för asymmetrisk polymerasmontering...

Schema för asymmetrisk polymerasmontering vid en replikationsgaffel. ( a ) CMG...


Åtkomstalternativ

Få full journalåtkomst i 1 år

Alla priser är NETTOpriser.
Moms tillkommer senare i kassan.
Skatteberäkningen kommer att slutföras i kassan.

Få tidsbegränsad eller fullständig artikelåtkomst på ReadCube.

Alla priser är NETTOpriser.


DNA-replikation har studerats från en mängd olika arter. För våra syften kommer vi att fokusera på vanliga teman för replikationsmekanismerna som finns både i prokaryoter och i eukaryoter. Detta avsnitt kommer att undersöka eukaryota DNA-polymeraser och accessoriska proteiner, och betona egenskaper som är gemensamma för de som ses i bakteriella enzymer.

Fem DNA-polymeraser, kallade a, d, b, e och g, har isolerats från eukaryota celler. Efter det paradigm som etablerats för att studera replikation i bakterier, har forskare försökt fastställa vilka proteiner som är involverade i en viss funktion med hjälp av både genetisk analys och biokemisk karakterisering. Även om inga genetiska screeningar för DNA-replikerande funktioner kan göras hos däggdjur, har en betydande mängd lärt sig genom att studera replikation in vitro av DNA som innehåller virala replikationsursprung, såsom de som finns i simianvirus 40 (SV40) eller bovint papillomvirus. Dessa däggdjursvirus har små kromosomer (ca 5 till 7 kb), och de kan replikeras helt i cellfria system. Användning av cellfria system som är kompetenta för replikering har möjliggjort en detaljerad analys av proteiner som krävs för denna process. Förmågan att störa aktiviteten hos designerade proteiner i ett cellfritt system, t.ex. genom att lägga till antikroppar som inaktiverar dem eller inhibitorer för att blockera deras aktivitet, ger möjligheten att testa om det proteinet krävs för DNA-replikation. I själva verket, denna interferens med ett protein i vitrohärmar informationen från fenotyperna av mutationer med förlust av funktion i generna som kodar för proteinet av intresse. Renade proteiner kan också kombineras för att rekonstituera de aktiviteter som behövs för fullständig syntes av den virala DNA-mallen. Framgång med en sådan rekonstitution tyder på att huvudkomponenterna har identifierats. Dessutom har proteiner som är homologa med de som identifierats i däggdjursceller hittats i jäst, och mutation av dessa gener ger ytterligare information om enzymernas biologiska funktion. Resultaten av dessa typer av studier presenteras i detta avsnitt.

Huvudpolymeraset för replikering av nukleärt DNA är DNA-polymeras d (Figur 5.27). Det krävs för syntes av både ledande sträng och eftersläpande sträng, åtminstone vid rekonstituerad i vitroreplikeringssystem. Den har två subenheter, ett polymeras (125 kDa) och en annan subenhet (48 kDa). Den katalyserar DNA-syntes med hög tillförlitlighet, och den innehåller den förväntade 3' till 5' exonukleasaktiviteten för korrekturläsning. Den har hög processivitet när den associeras med en analog av den bakteriella glidklämman (f2), kallad PCNA.

Figur 5.27. Eukaryota DNA-polymeraser och replikationsproteiner vid replikationsgaffeln. Det huvudsakliga replikativa DNA-polymeraset i kärnor är DNA-polymeras d. RFA är den funktionella motsvarigheten till bakteriell SSB, detta enkelsträngade bindande protein täcker det enkelsträngade DNA:t. En helikas katalyserar separationen av de två föräldrasträngarna. DNA-polymeras a (visas som en cirkel runt den nya primern) innehåller en primas som gör korta sträckor av RNA och DNA som fungerar som primers för DNA-syntes.

PCNA, eller prolifererande cellkärnantigen, identifierades initialt som ett antigen som endast förekommer i replikerande celler och endast vid vissa tidpunkter av cellcykeln (såsom S-fasen). Detta trimera protein har en ringstruktur som liknar den hos b2-glidklämman E. coliDNA-polymeras III (Figur 5.28), trots frånvaron av signifikant sekvenslikhet i proteinerna. Bindning av PCNA ger hög processivitet till polymeras d. PCNA är således både strukturellt och funktionellt analogt med E coli b underenhet. Varje subenhet av den trimera PCNA:n viks till två domäner, totalt sex domäner i ringen. Varje subenhet av dimeren E coli b-subenheten viks till tre domäner, vilket återigen skapar sex domäner i ringen. Således har glidklämman en mycket liknande struktur hos både bakterier och däggdjur.

Figur 5.28. Liknande strukturer av processivitetsfaktorer för DNA-replikation. Däggdjursproteinet, PCNA (överst), är en trimer, vars monomer har två liknande domäner. Trimeren bildar en cirkel som omger DNA och fungerar därför som en glidklämma. b-subenheten av DNA-polymeras III från E. coli är en dimer (botten), av vilken varje monomer har tre liknande domäner. Dessa domäner har en mycket liknande struktur som de för PCNA, trots att de endast har begränsad sekvenslikhet. Sålunda har funktionellt analoga glidklämmor i eukaryoter och prokaryoter liknande strukturer.

Mall-primer-övergångarna känns igen av multisubenheten replikationsfaktor C eller RFC. Som g-komplexet i E coli, är detta enzym ett ATPas, och det hjälper till att ladda processivitetsfaktorn PCNA. Således utför RFC en liknande funktion som det bakteriella g-komplexet.

En av de första eukaryota polymeraserna som isolerades var DNA-polymeras a, som nu erkänns som en katalysator för primersyntes. Detta enzym innehåller fyra polypeptidsubenheter, en med en polymerasaktivitet (170 kDa), två som innefattar en primasaktivitet (50 och 60 kDa), och en annan subenhet med (för närvarande) obestämd funktion (70 kDa). DNA-polymeras a har låg processivitet men hög trohet. Denna högtrohet är överraskande eftersom inget 3' till 5' exonukleas är associerat med enzymet. Polymeras a, möjligen med ytterligare primaser, katalyserar syntesen av korta segment av DNA och RNA som fungerar som primrar för de replikativa polymeraserna.

DNA-polymeras e är relaterat till polymeras d, och det kan spela en roll vid eftersläpande strängsyntes. Det är också beroende av PCNA, in vivo. Emellertid har inget krav identifierats för det i virusreplikationssystem in vitro.

Föreningen afidikolin kommer att blockera tillväxten av däggdjursceller. Det gör detta genom att förhindra DNA-replikation, och målen för detta läkemedel är DNA-polymeraserna a och d (liksom e). Det faktum att hämning av dessa DNA-polymeraser med afidikolin också stoppar DNA-replikation i däggdjursceller hävdar att a och d verkligen är ansvariga för replikering av nukleärt DNA i eukaryota celler. This conclusion is strongly supported by the phenotype of conditional loss-of-function mutations in the genes encoding the homologs to these polymerases in yeast. Such mutants do not grow at the restrictive temperature, indicating that d and a are the replicative polymerases. The biochemical evidence implicates polymerase a in primer formation, and d appears to be the major polymerases used to synthesize the new strands of DNA.


DNA Replication: Eukaryotic Elongation and Termination.

We discussed about the Initiation in the Eukaryotic cells in the last post. In the present post, let’s look into the Förlängning och den Uppsägning in Eukaryotic DNA Replication.

During Initiation, a repertoire of proteins bind and unwind the DNA at the ursprung. To this protein complex the polymerass are loaded. The polymerases work together with other proteins for the elongation of the daughter strands.

(Just for info: Read more about the eukaryotic origins in the paper titled ‘Making Sense of Eukaryotic DNA Replication Origins‘.)

Elongation:

The first polymerase to initiate the DNA synthesis is the DNA polymerase α, which exists in the form of DNA polymerase α-primase complex. The primase subunit synthesizes the RNA primers (around 7-12 nucleotides) which are then transferred to the polymerase domain and extended with DNA bases (around 20-25 nucleotides). Replication factor C (RFC) initiates a reaction called polymerase switching. The DNA strands are then extended by other polymerases namely the DNA polymerase δ och DNA polymerase ε.

Leading strand synthesis:

Fig 1: Synthesis of leading or continuous strand.

As DNA pol α completes synthesizing RNA primer and adding DNA bases, the RFC causes dissociation of DNA pol α and assembles proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the region of the primer terminus. PCNA is a DNA clamp for DNA polymerases.

Pol ε has been reported as the main leading strand synthesis polymerase (in Saccharomyces cerevisiae). In the leading strand as the replication is continuous and the primer is synthesized only once and the extension is carried out (fig 1).

Lagging strand synthesis:

Fig 2: Synthesis of lagging or discontinuous strand with series of Okazaki fragments.

Polymerases δ is the major polymerase in lagging-strand synthesis. The replication in the lagging strands is discontinuous and takes place with formation of several Okazaki fragments (fig 2).

Okazaki fragments (fig 3) generated in eukaryotes during lagging-strand synthesis are around 200 bases (prokaryotes, around 2000 bases) long. As several Okazaki fragments are made, Polymerase switching during synthesis of Okazaki fragments is of higher importance.

Hence an Okazaki fragment is made up of RNA nucleotides (7-10 nucleotides), then around 10-20 nucleotides of DNA bases are added by the DNA pol α. Following which, the RFC causes polymerase switching and the deoxyribonucleotides are added by DNA pol δ held by the PCNA, the sliding klämma (see the figure below). DNA pol δ dissociates after the synthesis of the entire DNA stretch, as it approaches the previous RNA primer.

(Just for info: Know more about PCNA)

The proteins involved in the replication, especially PCNA (Boehm et al., 2016).

RNA primers are removed by RNase H1, such that one ribonucleotide remains still attached to the DNA (3′ end) part of the Okazaki fragment. This left out ribonucleotide is then removed by flap endonuclease 1 (FEN 1). Polymerase δ then fills the gaps formed between Okazaki fragments following the primer removal. De nick formed between the Okazaki fragment and the lagging strand are filled in by DNA ligase I, hence forming single lagging strand.

Fig 4: Removal of RNA primer and linking of individual Okazaki fragments.

Nucleosome Assembly:

During elongation, there is continuous disassembly as reassembly of the nucleosome packaging along the DNA, too. As we know, one of the feature of the eukaryotic DNA is that it is packaged in form of highly compact structures called the Kromosomer. It involves winding of the negatively charged DNA around the basic proteins called histoner to form structures called nukleosomer (fig below). Each nucleosome is composed of 8 histon proteins, two each of H2A, H2B, H3 and H4. Histone H1 forms the linker between two nucleosomes.

The nucleosomes.

During replication, two nucleosomes in front of the replication fork, that is unreplicated DNA, becomes destabilized. Hence the replication fork movement causes DNA packaging to disorganise to allow the replication proteins to interact with the DNA.

I den replicated portion, the leading and lagging strands were nucleosome-free till about 225 bp and 285 bp, respectively. Following this region, the DNA was packaged with histone octomer but some lacked histone H1. After around 450 bp to 650bp from the replication fork, complete nucleosomes with H1 were detected in the daughter strands. Hence there is stepwise assembly of daughter strands into complete nucleosome.

The parental nucleosomes disassociate and randomly bind the daughter DNA strands, such that each strands has halv av parental nucleosomes. The remaining nucleosome components required for packaging the two daughter strands, are synthesized de novo and assembled onto the daughter strands.

Termination:

Following the successful elongation, the replication has to be terminated to give two separate copies of the DNA.

Involving two adjacent replication forks:

As the eukaryotic cell have a large number of ursprung, the termination involves merging of two adjacent replication forks. This includes four different steps:

– Dissolution:

The DNA stretch between the two adjacent forks (fig 5.a) is unwound (fig 5.b) and the approaching CMGs pass each other (fig 5.c). The last Okazaki fragment is processed by DNA pol δ and FEN1 (fig 5.d).

De gaps in the daughter strands (as in normal Okazaki fragments) are filled in and two oppositely approaching synthesized strands are ligated.

– Dissociation of replisome:

The replisome complex dismantles after the convergence of the two replication fork. This process involves termination-specific polyubiquitylation of Mcm7 and the p97/VCP/Cdc48 segregase (fig 5.e).

– Decatenation:

If there are any intertwinings in the daughter DNA strands or catenanes, they are removed utilising topoisomerase II segregating the two strands.

Fig 5: Termination involves merging of the two neighbouring forks (Dewar & Walter, 2017).

Involving the ends of the Chromosomes:

As is known the DNA in eukaryotic chromosomes is a linjär molecule, the termination in eukaryotic DNA also involve completing replication at the slutar of chromosomes known as Telomeres (fig 6).

Fig 6: Telomeres form protective end of eukaryotic linear DNA (Aulinas, 2013).

During the synthesis of Okazaki fragments, RNA-primer förse 3′-OH group for 5′ to 3′ replication. On the removal of RNA primer, from the eftersläpande strand vid chromosome end, the end remains unreplicated and the newly synthesized strand is shortened (fig 7).

Fig 7: Shortening of the chromosome ends.

This shortening of the chromosome is prevented by the presence of special repeats of sequences called telomerer (and telomere-associated proteins) at the ends of DNA in chromosomes contain. För t.ex. human Chromosomes are protected by telomeres having repeated sequences of (TTAGGG)n of about 15–20 kb at birth. These structures protect the ends of chromosomes from being mistakenly considered as DNA double strand breaks (DSB).

In normal somatic cells, the telomeric region of eukaryotic chromosomes are shortened with each round of DNA replication. After certain number of DNA replications, and hence cell divisions, the telomeres are shortened to an extent that it leads to replicative cell senescence eller apoptos.

(Just for info: Please read about the Nobel prize given to a work on telomeres.)

Dock i könslinje och cancer cells, an enzyme called telomerase, extends the ends of the chromosomes, especially the 5′ end of the lagging strands. The ability to maintain the length of the telomeres, make these cells odödlig.

Telomerase is a Omvänt transkriptas which has a RNA mall, känd som template-encoding RNA molecule (TER) for extension of the telomeric DNA (fig 8). Det grundläggande protein component of telomerase is known as TERT (TElomerase Reverse Transcriptase).

In humans, the RNA template has the sequence AUCCCAAUC. The newly synthesized telomeric DNA repeats are added to the overhanging single-stranded 3′ end of the DNA (fig 8).

Fig 8: Synthesis of telomeric DNA repeats by Telomerase (Verhoeven et al, 2014).

(Just for info: visit to watch the animation on action of Telomerase and much more.)

After strand extension on the 3′ end by the telomerase is completed, DNA pol α and DNA ligase complete the DNA strand synthesis.

This is all for this post. Hope u like this post, if yes please comment, like and share!!

Also follow us on Facebook, Twitter, Instagram or mail us ([email protected]).

Read more posts by The Biotech Notes:

Bambara et al. (1997) Enzymes and Reactions at the Eukaryotic DNA Replication Fork. J Biol Chem. 272(8):4647-50.

Abmayr and Workman (2012) Holding on through DNA Replication: Histone Modification or Modifier? Cell. 150(5):875-7.

Verhoeven et al (2014). Cellular aging in depression: Permanent imprint or reversible process?: An overview of the current evidence, mechanistic pathways, and targets for interventions. BioEssays 36(10):968-78.

Bailey et al (2015) Termination of DNA replication forks: “Breaking up is hard to do”.Nucleus 6 (3):187-196.

Dewar & Walter (2017) Mechanisms of DNA replication termination. Nature Reviews Molecular Cell Biology 18:507–516.

Aulinas (2013) Telomeres, aging and Cushing’s syndrome: Are they related? Endocrinology and Nutrition (English Edition) 60(6): 329-335.

Boehm et al. (2016) The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication. Enzymes 39:231-54.