Information

Vad är ApoCas9 i CRISPR-Cas9-systemet?

Vad är ApoCas9 i CRISPR-Cas9-systemet?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Jag läser för närvarande en artikel om en viss analys av Cas9-nukleaser. I ett av experimenten har de använt ApoCas9 (Apo-varianter av andra CRISPR-nukleaser) som någon form av kontroll.

Men hela artikeln har de inte definierat ApoCas9? Jag kollade på nätet av definitionen och aktiviteten av ApoCas9, men kom över utan några fruktbara resultat.

En universell metod för känslig och cellfri detektion av CRISPR-associerade nukleaser


I allmänhet används "apo" för att indikera ett apoenzym - det vill säga proteindelen av ett enzym utan väsentlig(a) kofaktor(er).

Detta är faktiskt definierat i Experimentell avsnitt av tidningen:

Cas9/Cpf1 utan gRNA (ApoCas9/Cpf1)

Så i det här fallet är ApoCas9 Cas9-endonukleas som inte är bundet till ett guide-RNA.


CRISPR-Cas9


Introduktion till CRISPR/Cas9-systemet

Även om nyligen utvecklade programmerbara redigeringsverktyg, såsom zinkfingernukleaser och transkriptionsaktivatorliknande effektornukleaser, avsevärt har förbättrat kapaciteten för exakt genommodifiering, har dessa tekniker begränsningar. CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-teknologi representerar en betydande förbättring jämfört med dessa andra nästa generations genomredigeringsverktyg, och når en ny nivå av inriktning, effektivitet och användarvänlighet. CRISPR/Cas9-systemet möjliggör platsspecifik genomisk inriktning i praktiskt taget vilken organism som helst.

Typ II CRISPR/Cas-systemet är ett prokaryotiskt adaptivt immunsvarssystem som använder icke-kodande RNA för att vägleda Cas9-nukleaset för att inducera platsspecifik DNA-klyvning. Denna DNA-skada repareras av cellulära DNA-reparationsmekanismer, antingen via den icke-homologa änden som sammanfogar DNA-reparationsvägen (NHEJ) eller den homologiriktade reparationsvägen (HDR).

CRISPR/Cas9-systemet har utnyttjats för att skapa en enkel, RNA-programmerbar metod för att förmedla genomredigering i däggdjursceller, och kan användas för att generera gen-knockouts (via insättning/deletion) eller knockins (via HDR). För att skapa genstörningar (Figur 1), genereras ett enda guide-RNA (sgRNA) för att styra Cas9-nukleaset till en specifik genomisk plats. Cas9-inducerade dubbelsträngsbrott repareras via NHEJ DNA-reparationsvägen. Reparationen är felbenägen, och därför kan insertioner och deletioner (INDEL) introduceras som kan störa genens funktion.

Principen för CRISPR/Cas9-medierad genstörning. Ett enda guide-RNA (sgRNA), bestående av en crRNA-sekvens som är specifik för DNA-målet, och en tracrRNA-sekvens som interagerar med Cas9-proteinet (1), binder till en rekombinant form av Cas9-protein som har DNA-endonukleasaktivitet (2 ). Det resulterande komplexet kommer att orsaka målspecifik dubbelsträngad DNA-klyvning (3). Klyvningsstället kommer att repareras av den icke-homologa ändanslutningsvägen (NHEJ) DNA-reparationsvägen, en felbenägen process som kan resultera i insertioner/deletioner (INDEL) som kan störa genfunktionen (4).

CRISPR/Cas9-teknologin har revolutionerat genomredigering, vilket möjliggör en tidigare ouppnåelig nivå av genomisk inriktning, effektivitet och enkelhet. Guide-it-produkter förbättrar användbarheten av CRISPR/Cas9-systemet ytterligare genom att tillhandahålla en strömlinjeformad metod för:


Vem äger CRISPR 2021? Det är ännu mer komplicerat än du tror

Frågan om vem som äger CRISPR, det genetiska redigeringsverktyget som förväntas förändra modern medicin, är en förvirrande röra av juridiska strider, oklara namnkonventioner och subtila variationer i molekylär form och funktion. De enheter som så småningom äger patenträttigheterna till dessa verktyg kommer nästan säkert att kontrollera vem som kan använda det, hur det används och hur mycket det kostar.

Den ursprungliga CRISPR-patentstriden mellan UC Berkeley och MIT-Harvard Broad Institute har inte varit vacker. Patentstrider är det sällan, men debatten om vem som äger CRISPR-Cas9 har varit särskilt het. Det är inte förvånande. Eftersom CRISPR faktureras som medicinens framtid, är möjligheten att äga och licensiera en del av verktyget avgörande för en rad företag som bygger på den ursprungliga CRISPR-Cas9-teknologin.

Men vem som äger CRISPR 2021 är betydligt mer komplicerat än vad det var för bara några år sedan. När fler företag, forskare och akademiska institutioner lämnar in patentansökningar för subtilt olika CRISPR-molekyler, är det inte längre möjligt att begränsa de immateriella rättigheterna till bara två eller tre stora aktörer.

Varför CRISPR är viktigt

CRISPR är i grunden en bakteriell försvarsmekanism. När ett virus infekterar en bakterie (känd som en bakteriofag), kan bakterierna använda en CRISPR-associerad molekyl (Cas) för att skära bakteriofagens DNA. Bakterierna infogar sedan bitar av fag-DNA i sitt eget genom, vilket gör det möjligt för den att känna igen och förstöra fagerna i framtiden.

Bakteriofager infogar sitt DNA (i röd, mittenbild) i en bakterie. CRISPR är i huvudsak ett bakteriellt immunsystem för att skära och lagra fag-DNA så att bakterierna kan känna igen - och bekämpa - fagen i framtiden. Kredit: Victor Padilla-Sanchez, The Catholic University of America, Källa: National Institutes of Health på Flickr

Det fina med Cas-proteiner är att de kan programmeras för att känna igen och klippa specifika DNA-sekvenser. Det är därför som CRISPR ofta kallas "genetisk sax". Genom att ge en Cas-molekyl instruktioner om var man ska skära DNA med hjälp av en guide-RNA-molekyl (gRNA), har CRISPR kraften att inaktivera alla gener som den är programmerad att hitta.

Konsekvenserna av att skära DNA är enorma. CRISPR-baserade terapier har redan visat kliniskt löfte för tillstånd som ärftlig barnblindhet och sicklecellanemi. Tekniken kan bota många genetiska sjukdomar genom att stänga av en gen som inte var tänkt att vara på från början. CRISPR kan också klippa DNA, ersätta avbrottet med ett nytt segment och korrigera en felaktig genetisk mutation.

Alla vill ha en bit av CRISPR-pajen

Den mest kända CRISPR-Cas-molekylen är Cas9. Det är här den ursprungliga CRISPR-patentstriden börjar, och tvisten pågår fortfarande. Både UC Berkeley och MIT-Harvard Broad Institute gjorde anspråk på IP-rättigheter till CRISPR-Cas9 2012. Eftersom Broad Institute betalade för att påskynda sin ansökan, tilldelades dess patent först även om UC Berkeley ansökte först. Men USA:s patent- och varumärkesmyndighet (USPTO) bytte till ett först-till-fil-system som trädde i kraft 2013 och satte scenen för patentstriden.

Flera företag grundade på de ursprungliga CRISPR-Cas9 IP-rättigheterna har också överlappningar i sina patent. Och vissa patent täcker endast rätten att använda CRISPR-Cas9 för vissa sjukdomar eller tillämpningar.

Källor som kontaktades för den här artikeln gick bara med på att tala på villkoret av anonymitet och att de inte citerades direkt. Så även om CRISPR-Cas9-patenttvisterna för närvarande inte är huvudnyheter, vidtar de som är direkt involverade i tekniken alla försiktighetsåtgärder för att deras ord inte ska misstolkas i nuvarande eller framtida rättsliga förfaranden.

Hittills är de företag som grundats av var och en av spelarna i kärnan i Cas9 patenttvisten:

Utanför patenttvisten har Doudna och Charpentier erkänts som medupptäckare av CRISPR "saxen". Deras ursprungliga samarbete 2011 gav dem slutligen Nobelpriset i kemi 2020. Det var en historisk vinst – Doudna och Charpentier blev de första kvinnorna att dela priset och det gav syntetisk biologi en ny nivå av allmänhetens medvetenhet.

All denna uppmärksamhet har fokuserats på CRISPR-Cas9. Men Ca9 är inte bara en molekyl. Det är en hel mängd vildtyp (naturligt förekommande) och konstruerade enzymer för att binda och klyva DNA. Cas9-molekyler är inte heller de enda CRISPR-enzymerna. Hela familjer av CRISPR-komplex som Cas12, Cas14, CasX och CasY har upptäckts och patenterats av olika organisationer, företag, forskare och akademiska institutioner.

Även Cas namnkonventioner är förvirrande. Olika enheter använder lite olika namngivningsriktlinjer – CasX i ett namnsystem är Cas12e i ett annat. Vissa CRISPR Cas-enzymer är också nära besläktade med andra, nästan som molekylära kusiner med liten skillnad mellan dem.

Det finns hundratals om inte tusentals Cas-varianter, som alla potentiellt skulle kunna patenteras. Det är här CRISPR IP-rättigheterna blir ännu mer fragmenterade.

Andra spelare i patentspelet

De första institutionerna att upptäcka CRISPR är inte de enda som har patent. Vem som först upptäckte CRISPR är naturligtvis resultatet av mycket debatt. Utöver UC Berkeley och Emmanuelle Charpentier upptäckte Vilnius University också hur man använder Cas9 samtidigt. Vilnius universitet har dock lämnats utanför den ursprungliga upptäcktslistan eftersom det inte visade alla komponenter som är nödvändiga för genetisk redigeringsaktivitet.

CRISPR Cas9 (vit) använder guide-RNA för att lokalisera och skära mål-DNA-sekvensen. Källa: WikiMedia

Nu äger företag som DowDuPont, MilliporeSigma och Cellectis alla CRISPR-Cas9-patent.

Vissa, som DowDuPoint, har köpt sina patentavtal från flera CRISPR-enheter som Caribou Biosciences och Emmanuelle Charpentier. Ett patentpoolande licensieringsföretag, MPEG LA, har gått en annan väg. Företaget håller på att samla flera patent från olika företag, vilket ger det potentiell tillgång till ett brett utbud av CRISPR immateriella rättigheter.

Problemet är dock att vart och ett av dessa patent representerar små segment av en mycket större paj. Det är ännu inte klart vilka Cas-enzymer eller vilka varianter av dessa enzymer som i slutändan kommer att vara användbara. Bara för att en forskare eller ett företag innehar CRISPR-Cas-patent betyder det inte nödvändigtvis att Cas-komplexen kommer att vara effektiva för genetisk redigering. Att upptäcka CRISPR Cas-molekyler är relativt enkelt. Att hitta sådana som fungerar är mycket mer utmanande.

Vad händer om alla äger CRISPR?

Det finns fyra möjliga scenarier för framtiden för CRISPR-patenträttigheter. En är att de flesta som ansöker om CRISPR-patent är framgångsrika. I det här fallet kan det vara mycket svårt för forskare och entreprenörer att ta reda på om en Cas-molekyl redan är patenterad och vem som äger den IP-adressen. Detta kan skapa en flaskhals för forskning och upptäckt om forskare tvingas vada igenom alla CRISPR-varianter för att hitta de de behöver.

CRISPR-Cas9 kan korrigera den genetiska mutationen som påverkar produktionen av proteinet dystrofin, den underliggande orsaken till Duchennes muskeldystrofi (DMD). Återställande av dystrofin (färgat grönt), bota till minst 60 % av DMD-patienterna. Kredit: Courtney Young, M.S., Melissa Spencer lab, University of California, Los Angeles. Källa: NIH

Det andra scenariot skapar en värld där många institutioner och företag äger CRISPR-rättigheter, men den är relativt organiserad (när det första dammet äntligen lägger sig). Det skulle finnas regler som vägleder hur CRISPR kan delas och användas i forskning för att göra det mer tillgängligt.

Ett tredje scenario skulle vara ett monopol på CRISPR-Cas9-patent av en eller två stora aktörer. De skulle kontrollera forsknings- och tillverkningslandskapet genom att slå sig samman med andra aktörer eller köpa ut dem. Detta är dock ganska osannolikt. Företag och forskare har redan utvecklat tydligare IP-rättigheter med sina egna iterationer av molekyler som CasX. Andra företag har utvecklat egna CRISPR-komplex. Även om alla Cas9-patent togs över av en enhet, skulle andra alternativ fortfarande finnas på CRISPR-Cas-marknaden.

Det finns också ett fjärde scenario där Cas9 inte blir framtidens molekyl. Även om Ca9 var det första CRISPR-enzymet som upptäcktes, är det inte nödvändigtvis det lättaste att arbeta med. Molekylära komplex som CasX är mindre, lättare att leverera till patienter och gör färre genetiska skärningar utanför målet. Även om Cas9 fortfarande är på topp i rättsliga tvister, kanske det inte blir den molekyl som valts för många applikationer.

Det bör sägas att akademiska institutioner sannolikt kommer att ha tillgång till Cas-molekyler till liten eller ingen kostnad. Det är traditionellt för akademiska forskare att använda patenterade life science-verktyg om de inte planerar att göra vinst själva.

CRISPR har och har inte

CRISPR-applikationer är inte begränsade till biofarma och terapeutika. Lantbruksteknikplattformar eller cellkulturkött använder redan CRISPR-teknik. Hittills fungerar det här systemet tillräckligt bra: Ett dussintal företag innehar en första Cas9 IP, licensierar ut den och gör vinst samtidigt som de utvecklar sina egna produkter och terapier. Det är så patentsystemet ska fungera. Men i ett monopol med en eller två stora aktörer kan licensavgifterna som IP-innehavare kan ta ut vara praktiskt taget obegränsade.

Tekniska basgrödor med CRISPR förväntas vara ett nyckelverktyg för att modifiera grödor för att ge högre avkastning och vara mer motståndskraftiga mot effekterna av klimatförändringar. Källa: DOI: 10.1126/science.aar7191

En andra fråga uppstår om ett företag behöver använda CRISPR för flera applikationer men mer än ett företag innehar delar av CRISPR-rättigheterna för specifika applikationer. Nyare företag kan behöva betala flera licensavgifter för att få tillgång till tekniken. Eftersom dessa avgifter vanligtvis är höga, särskilt för ett så kraftfullt verktyg som CRISPR, kan många lovande företag köras ur spelet enbart av avgifterna. Detta scenario kan kväva innovation och vetenskaplig kreativitet.

Vill du fortfarande patentera CRISPR? Här är vad du behöver veta

Den största utmaningen för alla som försöker reda ut CRISPR-patenträttigheter är att helt förstå hur många patent det finns.

En sökning i USPTO avslöjade 262 patent eller patentansökningar som listar CRISPR-Cas9 och över 5 000 allmänna CRISPR-patent. Och detta är bara patentansökningarna för Cas9. Detta inkluderar inte det växande antalet patent för andra Cas-molekyler eller Cas-molekyler som ännu inte har upptäckts. Detta inkluderar inte heller patentansökningar i andra stora syntetiska biologiregioner som Kina, Europa, Storbritannien och Israel.

Konkurrensen om CRISPR-patent kommer sannolikt inte att minska i framtiden eftersom fler företag och akademiska centra klättrar på att gå med i tävlingen. Kapplöpet har blivit allt mer globalt med fler länder som ansöker om CRISPR-patent – ​​nya patent lämnas in med en hastighet av 200 per månad.

Vad som inte är klart är hur dessa enorma antal CRISPR-patent kommer att påverka vetenskapens framtid. Kommer de att hämma framsteg genom att begränsa den kommersiella användningen av tekniken, eller kommer forskare att segra och göra nya terapier tillgängliga för alla? När dammet lägger sig – om det alls gör det – är förhoppningen att CRISPR-tekniken ska vara tillgänglig för ett brett spektrum av applikationer till en konkurrenskraftig kostnad. Makten att konstruera biologi bör inte begränsas till de mycket få. Vi är nu inne i biologins tidsålder. Om vi ​​ska bygga en bättre framtid kan vi inte lämna vetenskapens grundläggande löfte i stoftet.

Särskilt tack till Marianna Limas för ytterligare forskning och Lana Bandoim för ytterligare skrivande för detta stycke.

Vill du höra mer om hur syntetisk biologi förändrar medicinens framtid? Gå med i SynBioBetas speciella Biopharma-eventSkaffa din biljett idag!

Fiona Mischel

Fiona Mischel är chefredaktör för SynBioBeta. Hon täcker ofta upp hållbarhet, CRISPR-forskning, livsmedels- och jordbruksteknik och bioteknik för rymdresor. Hon brinner för att visa hur vetenskapliga innovationer kan bekämpa vår klimatkris och positivt påverka samhällen över hela världen.


Frågor

I april 2015 rapporterade en kinesisk grupp om den första appliceringen av CRISPR/Cas9 på (icke-livsdugliga) mänskliga embryon. Denna utveckling har tillsammans med de sjunkande kostnaderna för tekniken utlöst en stor bioetisk debatt om hur långt tekniken ska användas. Tekniken står inför två stora problem.

Den första frågan är ett filosofiskt dilemma. Den fokuserar på i vilken utsträckning CRISPR/Cas9 ska användas för att förändra "könslinjeceller" - ägg och spermier - som är ansvariga för att överföra gener till nästa generation. Även om det kommer att ta många år till innan tekniken kommer att vara lönsam att använda för att skapa designerbebisar, har en offentlig debatt redan börjat om denna fråga. Så stor är rädslan att vissa forskare, inklusive några som hjälpte pionjären CRISPR/Cas9, har krävt ett moratorium för dess användning i könsceller.

Den andra frågan handlar om säkerhet. Ett av de stora problemen är att tekniken fortfarande är i sin linda och kunskapen om arvsmassan är fortfarande mycket begränsad. Många forskare varnar för att tekniken fortfarande behöver mycket arbete för att öka dess noggrannhet och se till att förändringar som görs i en del av genomet inte inför förändringar någon annanstans som kan få oförutsedda konsekvenser. Detta är en särskilt viktig fråga när det gäller användningen av tekniken för tillämpningar riktade mot människors hälsa. En annan kritisk fråga är att när en organism, såsom en växt eller insekt, har modifierats är de svåra att skilja från vildtypen och när de väl släpps ut i miljön kan den äventyra den biologiska mångfalden.

Politiker diskuterar fortfarande om vilka begränsningar de ska sätta på tekniken. I april 2015 utfärdade US National Institutes of Health ett uttalande som indikerade att det inte kommer att finansiera någon forskning som använder genomredigeringsverktyg som CRISPR i mänskliga embryon. Samtidigt har Storbritanniens myndighet för mänsklig befruktning och embryologi, under vars uppdrag sådan forskning skulle falla, indikerat att CRISPR/Cas9-teknologin kan användas på hybridembryon från människa och djur under 14 dagar gamla. Alla forskare som arbetar inom detta område måste först få en licens från myndigheten. Andra ledande brittiska forskningsråd har indikerat att de stödjer fortsatt användning av CRISPR/Cas9 och andra genomredigeringsverktyg i preklinisk forskning.

När tillsynsmyndigheter diskuterar vilka begränsningar som ska tillämpas med CRISPR/Cas9, har tekniken blivit föremål för en stor patenttvist. Den första ansökan om patent på teknologin lämnades in av DuPont i mars 2007 (WO/2007/025097). Detta omfattar användningen av tekniken för att utveckla fagresistenta bakteriestammar för livsmedelsproduktion, foder, kosmetika, personliga hygienprodukter och veterinärprodukter. Sedan dess har tre tungt finansierade nystartade bioteknikföretag och ett halvdussin universitet ansökt om patent. Två stora konkurrerande patentanspråk har lämnats in i USA. Den första, inlämnad den 25 maj 2015, grundar sig i arbetet som leds av Jennifer Doudna vid University of California, Berkeley, och Emmanuelle Charpentier, ursprungligen vid University of Vienna och nu vid Helmholz Center for Infectious Research i Tyskland. Ansökan har 155 krav och täcker ett flertal applikationer för en mängd olika celltyper (US patentansökan nr. PCT/US2013/032589). Den andra lämnades in av MIT-Harvard Broad Institute den 12 december 2012 för Feng Zhangs arbete som fokuserade på användningen av CRISPR/Cas9 för genomredigering i eukaryota celler. Det fick status som snabbspår och beviljades den 15 april 2014 (US-patent nr 8 697 359). I april 2015 ansökte Charpentier och universiteten i Kalifornien och Wien om patentet till US Patent and Trademark Office. Det kommer att ta flera år för patenttvisten att avgöras. De rättsliga bråken om patent kommer sannolikt inte att påverka användningen av CRISPR för grundforskning eftersom tekniken är tillgänglig via ett arkiv med öppen källkod. Det kan dock ha en inverkan på kliniska tillämpningar som använder tekniken.

Den här vetenskapliga profilen skrevs av Lara Marks i juni 2016 med generös input från Silvia Camporesi, Xiofan Zeng och Jonathan Lind. Verket uppdaterades av Lara Marks i oktober 2020.


Genredigerande "sax"-verktyg CRISPR-Cas9 kan också vara en genetisk "dimmer switch"

I en serie experiment med laboratorieodlade bakterier har Johns Hopkins-forskare hittat bevis på att det finns en andra roll för det allmänt använda genskärningssystemet CRISPR-Cas9— som en genetisk dimmerbrytare för CRISPR-Cas9-gener. Dess roll att ringa ner eller dämpa CRISPR-Cas9-aktivitet kan hjälpa forskare att utveckla nya sätt att genetiskt modifiera celler för forskningsändamål.

CRISPR-Cas9, som först identifierades i arvsmassan hos tarmbakterier 1987, är en naturligt förekommande men ovanlig grupp gener med potential att skära DNA-sekvenser i andra typer av celler som realiserades 25 år senare. Dess värde inom genteknik—programmerbar genförändring i levande celler, inklusive mänskliga celler— uppskattades snabbt, och dess utbredda användning som genom-"redaktör" i tusentals laboratorier över hela världen uppmärksammades vid tilldelningen av Nobelpriset i kemi förra året till dess amerikanska och franska medutvecklare.

CRISPR står för klustrade, korta palindromiska upprepningar med regelbundet mellanrum. Cas9, som refererar till CRISPR-associerat protein 9, är namnet på enzymet som gör DNA-skivan. Bakterier använder naturligt CRISPR-Cas9 för att skära av viralt eller annat potentiellt skadligt DNA och inaktivera hotet, säger Joshua Modell, biträdande professor i molekylärbiologi och genetik vid Johns Hopkins University School of Medicine. I den här rollen säger Modell, "CRISPR är inte bara ett immunsystem, det är ett adaptivt immunsystem som kan komma ihåg hot som det tidigare har stött på genom att hålla fast i en kort bit av deras DNA, vilket är besläktat med en muggshot." Dessa muggbilder kopieras sedan till "guide-RNA" som talar om för Cas9 vad som ska klippas.

Forskare har länge arbetat med att reda ut de exakta stegen i CRISPR-Cas9s mekanism och hur dess aktivitet i bakterier ställs upp eller ner. Letar efter gener som antänder eller hämmar genskärningssystemet CRISPR-Cas9 för den vanliga, halsflussframkallande bakterien Streptococcus pyogenes, fann Johns Hopkins-forskarna en ledtråd om hur den aspekten av systemet fungerar.

Specifikt hittade forskarna en gen i CRISPR-Cas9-systemet som, när den inaktiverades, ledde till en dramatisk ökning av systemets aktivitet i bakterier. Produkten av denna gen verkade programmera om Cas9 för att fungera som en broms, snarare än som en "sax" för att ringa ner CRISPR-systemet.

"Ur ett immunitetsperspektiv måste bakterier öka CRISPR-Cas9-aktiviteten för att identifiera och befria cellen från hot, men de måste också slå ner den för att undvika autoimmunitet när immunsystemet av misstag attackerar komponenter i bakterierna själva", säger doktorand Rachael Workman, en bakteriolog som arbetar i Modells laboratorium.

För att ytterligare spika ner detaljerna om "bromsen" var lagets nästa steg att bättre förstå produkten av den inaktiverade genen (tracrRNA). RNA är en genetisk kusin till DNA och är avgörande för att utföra DNA-"instruktioner" för att göra proteiner. TracrRNA tillhör en unik familj av RNA som inte gör proteiner. Istället fungerar de som en sorts ställning som gör att Cas9-enzymet kan bära guide-RNA som innehåller muggskottet av invaderviruset och skära virusets matchande DNA-sekvenser.

TracrRNA finns i två storlekar: lång och kort. De flesta av de moderna genskärande CRISPR-Cas9-verktygen använder den korta formen. Forskargruppen fann dock att den inaktiverade genprodukten var den långa formen av tracrRNA, vars funktion har varit helt okänd.

De långa och korta formerna av tracrRNA liknar strukturen och har gemensamt förmågan att binda till Cas9. Den korta formen av tracrRNA binder också till guide-RNA:t. Den långa formen av tracrRNA behöver dock inte binda till guide-RNA:t eftersom den redan innehåller ett segment som efterliknar guide-RNA:t. "I huvudsak har långformade tracrRNA kombinerat funktionen av kortforms tracrRNA och guide-RNA", säger Modell.

Dessutom fann forskarna att medan guide-RNA normalt letar efter virala DNA-sekvenser, riktar långformade tracrRNA:er själva CRISPR-Cas9-systemet. Den långa formen av tracrRNA tenderar att sitta på DNA snarare än att skära den. När detta händer i ett visst område av en gen, förhindrar det att genen uttrycks eller blir funktionell.

För att bekräfta detta använde forskarna genteknik för att ändra längden på en viss region i lång form av tracrRNA för att få tracrRNA att se mer ut som ett guide-RNA. De fann att med den förändrade långa formen tracrRNA, betedde sig Cas9 återigen mer som en sax.

Andra experiment visade att i labbodlade bakterier med en riklig mängd tracrRNA i långform var nivåerna av alla CRISPR-relaterade gener mycket låga. När den långa formen av tracrRNA togs bort från bakterier ökade emellertid uttrycket av CRISPR-Cas9-gener hundra gånger.

Bakterieceller som saknar långformen tracrRNA odlades i laboratoriet under tre dagar och jämfördes med liknande odlade celler innehållande långformen tracrRNA. I slutet av experimentet hade bakterier utan den långa formen tracrRNA helt dött av, vilket tyder på att tracrRNA i långform normalt skyddar celler från sjukdomar och dödsfall som händer när CRISPR-Cas9-aktiviteten är mycket hög.

"Vi började få tanken att den långa formen förträngde men inte eliminerade sin egen CRISPR-relaterade aktivitet", säger Workman.

För att se om den långa formen av tracrRNA kunde omprogrammeras för att undertrycka andra bakteriegener, ändrade forskargruppen den långa formen av tracrRNA:s spacer-region för att låta den sitta på en gen som producerar grön fluorescens. Bakterier med denna muterade version av långformad tracrRNA glödde mindre grönt än bakterier som innehöll den normala långformen tracrRNA, vilket tyder på att långformen tracrRNA kan genetiskt modifieras för att slå ner andra bakteriegener.

Forskarna fann också de genetiska komponenterna i långformad tracrRNA i cirka 40% av Streptococcus-bakterier. Ytterligare studier av bakteriestammar som inte har den långa formen tracrRNA, säger Workman, kommer potentiellt att avslöja om deras CRISPR-Cas9-system är intakta, och andra sätt som bakterier kan slå tillbaka CRISPR-Cas9-systemet.

Den dimmerförmåga som experimenten avslöjade, säger Modell, erbjuder möjligheter att designa nya eller bättre CRISPR-Cas9-verktyg som syftar till att reglera genaktivitet för forskningsändamål. "I ett genredigeringsscenario kan en forskare vilja klippa en specifik gen, förutom att använda den långa formen tracrRNA för att hämma genaktivitet", säger han.


Ny, snabb CRISPR/Cas9-metod identifierar nyckelgener vid förnyelse av ryggmärg för zebrafisk

En ny, snabb screeningmetod använder CRISPR/Cas9-teknologi för att identifiera immunsystemrelaterade gener som spelar en avgörande roll för att reparera ryggmärgsskador på zebrafisk. Marcus Keatinge och Themistoklis Tsarouchas vid University of Edinburgh, U.K., och kollegor presenterar dessa resultat i tidskriften med öppen tillgång PLOS Genetik.

Hos människor och andra däggdjur läker inte avbrutna ryggmärgsnervförbindelser, så en ryggmärgsskada kan leda till permanent förlamning. Däremot kan zebrafiskar återhämta sig från ryggmärgsskada i en process som involverar inflammation som kontrolleras av makrofager - en typ av immunsystemceller. Den exakta processen genom vilken makrofager hjälper till att regenerera ryggmärgen hos zebrafisk är fortfarande mystisk.

För att hjälpa till att förtydliga denna process utvecklade Keatinge, Tsarouchas och kollegor en ny metod för att snabbt identifiera makrofagrelaterade gener som är involverade i förnyelse av ryggmärg av zebrafisk. Strategin använder CRISPR/Cas9-teknologi, som gör det möjligt för forskare att rikta in sig på och störa specifika gener och därigenom avslöja deras funktion. Molekyler kända som syntetisk RNA Oligo CRISPR guide RNA (sCrRNA) möjliggör denna genspecifika inriktning.

Forskarna använde den nya metoden för att studera ryggmärgsförnyelse hos larverzebrafiskar. Nyckeln till metoden var ett förscreeningssteg där de testade över 350 sCrRNA som riktar sig mot gener som redan är kända för att potentiellt spela en viktig roll i inflammationsrelaterad ryggmärgsregenerering. Att introducera dessa sCrRNA för zebrafisken möjliggjorde identifiering av 10 gener som, när de stördes, försämrade återhämtningen från ryggmärgsskada.

Ytterligare analys minskade listan till fyra gener som verkar vara avgörande för reparation av avbrutna spinalnervförbindelser, vilket validerar den nya metoden. En gen i synnerhet, tgfb1, verkar spela en viktig signalroll för att kontrollera inflammation under återhämtningsprocessen.

Den nya metoden och fynden kan hjälpa till att fördjupa förståelsen av ryggmärgsförnyelse hos zebrafisk. Forskarna säger också att metoden kan anpassas för att screena efter gener som också spelar viktiga roller i andra biologiska processer.

Författarna tillägger: "Zebrafisk kan helt och hållet regenerera sin ryggmärg efter skada. Med hjälp av en ny och mycket snabb screeningplattform upptäcker vi gener i immunsystemet som är avgörande för regenerering. Vi föreställer oss att våra resultat leder till nya insikter om oförmågan hos däggdjur att regenerera och vår mångsidiga screeningplattform för att anpassas till andra sjukdoms- eller skademodeller hos zebrafisk."


CRISPR-Cas9 för terapi: utmaningarna och sätten att övervinna dem

Sundaram Acharya,. Debojyoti Chakraborty, i genomteknik via CRISPR-Cas9 System, 2020

Abstrakt

Klustrad regelbundet mellanrum kort palindromisk upprepning/CRISPR-associerad (CRISPR Cas) är en komponent i det prokaryota adaptiva immunsystemet som har återanvänts för genomredigering de senaste åren. Precisionen, enkelheten och flexibiliteten i detta system har öppnat upp ett brett utbud av biologiska tillämpningar som täcker grundforskning till bioteknik och medicin. Dessutom erbjuder multiplexeringsmöjligheterna i CRISPR ett lovande tillvägagångssätt för att modellera eller korrigera vanliga polygena sjukdomar tillsammans med dess monogena och infektiösa motsvarigheter. Även om CRISPR inte är helt exakt och frågor kvarstår angående dess specificitet och leveranssätt, har robustheten och breda tillämpbarheten av detta genomredigeringsverktyg öppnat många sätt att ta itu med dessa problem. I det här kapitlet kommer vi att diskutera de första framstegen mot CRISPR-terapi, befintliga leveransmodaliteter, utmaningarna innan CRISPR-redigering innan det blir en terapeutisk möjlighet och de pågående ansträngningarna för att utveckla ett perfekt CRISPR-system för applicering från bänk till säng.


Vad är ApoCas9 i CRISPR-Cas9-systemet? - Biologi

ett CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, Mathura Road, New Delhi 110025, Indien
E-post: [email protected], [email protected]

Abstrakt

CRISPR–Cas9-systemet har revolutionerat processen att göra ändringar i organismers DNA-sekvens. Denna molekylära verktygslåda har funnits tillämplig i nästan alla grenar av biologiska vetenskaper, beroende på en förenklad modell av RNA-styrd DNA-bindning och klyvning. Berättelsen om CRISPR-Cas9 är en av upptäckter och utveckling där en komponent av bakteriell adaptiv immunitet har utnyttjats för att ta itu med viktiga biologiska frågor med hjälp av betydande input från fysikalisk-kemiska struktur-funktionsstudier. In this review, we trace the evolution of CRISPR–Cas9 from its predecessor genome editing tools and document its current status with an emphasis on chemical biology aspects of modulating its activity to generate a potent tool for gene therapy applications.


We would like to thank the Sharp lab members for discussion and critical reading of the manuscript, and M. Lindstrom for assistance on constructing figures. This work was supported by United States Public Health Service grants RO1-GM34277 and R01-CA133404 from the National Institutes of Health (P.A.S.), PO1-CA42063 from the National Cancer Institute (P.A.S.), and partially by Cancer Center Support (core) grant P30-CA14051 from the National Cancer Institute. X.W. is a Howard Hughes Medical Institute International Student Research fellow.

Conflict of Interests: The authors Xuebing Wu, Andrea J. Kriz and Phillip A. Sharp declare that they have no conflict of interests.

Supplementary Materials: The supplementary materials can be found online with this article at DOI 10.1007/s40484-014-0030-x.


New understanding of CRISPR-Cas9 tool could improve gene editing

The 3D structure of a base editor, comprised of the Cas9 protein (white and gray), which binds to a DNA target (teal and blue helix) complementary to the RNA guide (purple), and the deaminase proteins (red and pink), which switch out one nucleotide for another. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott and Audrone Lapinaite)

Within a mere eight years, CRISPR-Cas9 has become the go-to genome editor for both basic research and gene therapy. But CRISPR-Cas9 also has spawned other potentially powerful DNA manipulation tools that could help fix genetic mutations responsible for hereditary diseases.

Researchers at the University of California, Berkeley, have now obtained the first 3D structure of one of the most promising of these tools: base editors, which bind to DNA and, instead of cutting, precisely replace one nucleotide with another.

First created four years ago, base editors are already being used in attempts to correct single-nucleotide mutations in the human genome. Base editors now available could address about 60% of all known genetic diseases – potentially more than 15,000 inherited disorders — caused by a mutation in only one nucleotide.

The detailed 3D structure, reported in the July 31 issue of the journal Vetenskap, provides a roadmap for tweaking base editors to make them more versatile and controllable for use in patients.

“We were able to observe for the first time a base editor in action,” said UC Berkeley postdoctoral fellow Gavin Knott. “Now we can understand not only when it works and when it doesn’t, but also design the next generation of base editors to make them even better and more clinically appropriate.”

A base editor is a type of Cas9 fusion protein that employs a partially deactivated Cas9 — its snipping shears are disabled so that it cuts only one strand of DNA — and an enzyme that, for example, activates or silences a gene, or modifies adjacent areas of DNA. Because the new study reports the first structure of a Cas9 fusion protein, it could help guide the invention of myriad other Cas9-based gene-editing tools.

“We actually see for the first time that base editors behave as two independent modules: You have the Cas9 module that gives you specificity, and then you have a catalytic module that provides you with the activity,” said Audrone Lapinaite, a former UC Berkeley postdoctoral fellow who is now an assistant professor at Arizona State University in Tempe. “The structures we got of this base editor bound to its target really give us a way to think about Cas9 fusion proteins, in general, giving us ideas which region of Cas9 is more beneficial for fusing other proteins.“

Lapinaite and Knott, who recently accepted a position as a research fellow at Monash University in Australia, are co-first authors of the paper.

“This structure helps us understand base editors at a much deeper level,” said senior author Jennifer Doudna, UC Berkeley professor of molecular and cell biology and of chemistry and Howard Hughes Medical Institute investigator. “Now that we can see what we’re working with, we can develop informed strategies to improve the system.”

Editing one base at a time

In 2012, researchers first showed how to reengineer a bacterial enzyme, Cas9, and turn it into a gene-editing tool in all types of cells, from bacterial to human. The brainchild of Doudna and her French colleague, Emmanuelle Charpentier, CRISPR-Cas9 has transformed biological research and brought gene therapy into the clinic for the first time in decades.

The 3D structure of a base editor as it edits a stretch of DNA. (UC Berkeley graphic by Gavin Knott)

Scientists quickly co-opted Cas9 to produce a slew of other tools. Basically a mash-up of protein and RNA, Cas9 precisely targets a specific stretch of DNA and then precisely snips it, like a pair of scissors. The scissors function can be broken, however, allowing Cas9 to target and bind DNA without cutting. In this way, Cas9 can ferry different enzymes to targeted regions of DNA, allowing the enzymes to manipulate genes.

In 2016, David Liu of Harvard University and the Broad Institute of the Massachusetts Institute of Technology and Harvard combined a Cas9 with another bacterial protein to allow the surgically precise replacement of one nucleotide with another: the first base editor.

While the early adenine base editor was slow, the newest version, called ABE8e, is blindingly fast: It completes nearly 100% of intended base edits in 15 minutes. Yet, ABE8e may be more prone to edit unintended pieces of DNA in a test tube, potentially creating what are known as off-target effects.

The newly revealed structure was obtained with a high-powered imaging technique called cryo-electron microscopy (cryoEM). Activity assays showed why ABE8e is prone to create more off-target edits: The deaminase protein fused to Cas9 is always active. As Cas9 hops around the nucleus, it binds and releases hundreds or thousands of DNA segments before it finds its intended target. The attached deaminase, like a loose cannon, doesn’t wait for a perfect match and often edits a base before Cas9 comes to rest on its final target.

Knowing how the effector domain and Cas9 are linked can lead to a redesign that makes the enzyme active only when Cas9 has found its target.

“If you really want to design truly specific fusion protein, you have to find a way to make the catalytic domain more a part of Cas9, so that it would sense when Cas9 is on the correct target and only then get activated, instead of being active all the time,” Lapinaite said.

The structure of ABE8e also pinpoints two specific changes in the deaminase protein that make it work faster than the early version of the base editor, ABE7.10. Those two point mutations allow the protein to grip the DNA tighter and more efficiently replace A with G.

“As a structural biologist, I really want to look at a molecule and think about ways to rationally improve it. This structure and accompanying biochemistry really give us that power,” Knott added. “We can now make rational predications for how this system will behave in a cell, because we can see it and predict how it’s going to break or predict ways to make it better.”

“While base editors are now widely used to introduce precise changes in organisms ranging from bacteria to plants to primates, no one has previously observed the three-dimensional molecular structure of a base editor,” said Liu, who obtained his Ph.D. in 1999 from UC Berkeley and is a Howard Hughes Medical Institute investigator. “This collaborative project reveals the beautiful molecular structure of a state-of-the-art, highly active base editor — ABE8e — caught in the act of engaging a target DNA site.”

In addition to Lapinaite, Knott, Doudna and Liu, other paper co-authors are Cody Palumbo and Peter Beal of UC Davis, Enrique Lin-Shiao of UC Berkeley and Michelle Richter and Kevin Zhao of the Broad Institute, a collaboration between Harvard and the Massachusetts Institute of Technology.


Titta på videon: BSC 219 S2021 Lecture 24 Video 8 Cas9, tracrRNAs, crRNAs (Augusti 2022).