Information

Bindning av en makromolekyl M med en liten molekyl L - Biologi

Bindning av en makromolekyl M med en liten molekyl L - Biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bindning av en makromolekyl M med en liten molekyl L

GSK4112, en liten molekylär kemisk sond för cellbiologin hos den nukleära hemreceptorn Rev-erbα

Identifieringen av icke-porfyrinligander för den föräldralösa nukleära receptorn Rev-erba kommer att möjliggöra studier av dess roll som en hemsensor och regulator av metabolisk och dygnssignalering. Vi beskriver utvecklingen av en biokemisk analys som mäter interaktionen mellan Rev-erba och en peptid från nukleär receptor corepressor-1 (NCoR). Analysen användes för att identifiera en liten molekylligand för Rev-erba, GSK4112 (1), som var konkurrerande med hem. I celler, 1 profilerad som en Rev-erba-agonist i celler för att hämma uttrycket av den cirkadiska målgenen bmal1. Dessutom undertryckte 1 uttrycket av glukoneogena gener i leverceller och minskade glukosproduktionen i primära hepatocyter. Därför är 1 användbart som ett kemiskt verktyg för att undersöka funktionen av Rev-erba vid transkriptionell repression, reglering av dygnsbiologi och metabola vägar. Dessutom kan 1 tjäna som utgångspunkt för design av Rev-erba kemiska prober med in vivo farmakologisk aktivitet.


Småmolekylär inriktning av MUSASHI RNA-bindande aktivitet vid akut myeloid leukemi

MUSASHI (MSI)-familjen av RNA-bindande proteiner (MSI1 och MSI2) bidrar till ett brett spektrum av cancer, inklusive akut myeloid leukemi. Vi finner att den lilla molekylen Ro 08-2750 (Ro) binder direkt och selektivt till MSI2 och konkurrerar om sin RNA-bindning i biokemiska analyser. Ro-behandling i mus- och humana myeloid leukemiceller resulterar i en ökning av differentiering och apoptos, hämning av kända MSI-mål och en delad global genuttryckssignatur som liknar shRNA-utarmning av MSI2. Ro demonstrerar in vivo-inhibering av c-MYC och minskar sjukdomsbördan i en murin AML-leukemimodell. Således identifierar vi en liten molekyl som riktar sig mot MSI:s onkogena aktivitet. Vår studie ger ett ramverk för att rikta in sig på RNA-bindande proteiner i cancer.

Uttalande av intressekonflikt

J.D.C. är medlem i Scientific Advisory Board för Schrödinger. De återstående författarna deklarerar inga konkurrerande intressen.

Siffror

Ro 08–2750 (Ro) är en selektiv MSI RNA-bindande aktivitetshämmare. a Fluorescenspolarisering...

Ro interagerar med RNA-igenkänning...

Ro interagerar med RNA-igenkänningsmotiv 1 (RRM1) av MSI2. a Proteinyta...

Ro 08–2750 ökar differentieringen och...

Ro 08–2750 ökar differentiering och apoptos i myeloida leukemiceller. a Cytotoxicitetsanalys...

Ro 08–2750-behandling hämmar överlevnad...

Ro 08–2750-behandling hämmar överlevnaden av humana AML-cellinjer och patientceller.…

Ro 08–2750 behandling motsvarar...

Behandling med Ro 08–2750 motsvarar MSI2 shRNA-utarmad gensignatur. a Schema av…

Ro 08–2750 visar effekt i...

Ro 08–2750 visar effektivitet i en MLL-AF9 in vivo-modell. a Schema av…


Introduktion

Ribonukleinsyror (RNA) spelar en avgörande roll i många cellulära processer som överföring av genetisk information, avkänning och kommunikation av svar på cellulära signaler och till och med katalys av kemiska reaktioner [1]. Dessa processer moduleras ofta av andra molekyler, såsom joner eller små molekyler, vilket gör RNA till ett attraktivt terapeutiskt mål för nya läkemedel [2-4]. Ett väl studerat och kliniskt validerat exempel är den bakteriella ribosomen, ett molekylärt mål för många antibiotika [5]. Riboswitches, en klass av regulatoriska RNA-strukturelement inbäddade i oöversatta regioner av mRNA, utgör en annan intressant grupp av RNA-mål. Dessa strukturella element kan direkt binda en ligand för att reglera genfunktion utan behov av proteinkofaktorer [6,7]. Riboswitchar är vanliga i bakterieceller och förekommer sällan i eukaryota celler, vilket gör dem till lämpliga mål för nya antibakteriella läkemedel. Ett väl studerat exempel är FMN riboswitch, som kontrollerar uttrycket av gener som krävs för biosyntes och transport av riboflavin (vitamin B2) i bakterier [8]. Flera småmolekylära hämmare av FMN-riboswitchen med bevisade antibakteriella egenskaper har identifierats. Några av dessa småmolekylära hämmare inkluderar föreningar som roseoflavin [9,10] eller 5FDQD [11], som strukturellt liknar den naturliga liganden, såväl som strukturellt olika ligander med en annan kemotyp, till exempel ribocil och dess derivat [ 12]. Förutom riboswitch inkluderar andra medicinskt relevanta RNA virala RNA (dimeriseringsinitieringsställe för HIV-1 RNA [13]), självsplitsande grupp I-introner (t.ex. en inhibitor för td intron-RNA [14]), grupp II-introner (t.ex. inhibitorer av grupp IIB-intronsplitsning [15]) och virala ribozymer (t.ex. hepatit D-virus-ribozymhämning av aminoglykosider [16]) (för detaljer, se [17]) .

Att belysa rollen av RNA-ligandinteraktioner och design av nya RNA-bindande molekyler kan underlättas genom att analysera tredimensionella (3D) strukturer av RNA av intresse eller dess komplex med en ligand. Tyvärr är experimentell bestämning av 3D-strukturer en intensiv uppgift och måste ofta stödjas av beräkningsmodellering [18] eller utföras helt och hållet in silico (för genomgång av metoder för modellering av ribonukleinsyra-ligandinteraktioner se: [19]). Dessa begränsningar, tillsammans med ett ökande intresse för RNA som mål för terapeutisk intervention, framhäver behovet av att utveckla nya metoder för att förutsäga 3D-strukturen av RNA-ligandkomplex.

En av de mest använda beräkningsmetoderna som används för att förutsäga 3D-strukturerna hos makromolekyler med ligander är molekylär dockning [20,21]. Många av de för närvarande tillgängliga dockningsprogrammen designades från början för protein-protein- eller protein-ligand-dockning (t.ex. som AutoDock [22], AutoDock Vina [23], ICM [24] eller iDock [25]) medan några av dem senare anpassades eller omparameteriserades för att möjliggöra dockning av RNA-ligand, där RNA anges som receptor (Dock6, [26], ICM [27] eller AutoDock [28]). Ett fåtal program designades och optimerades specifikt för dockning av ligander till RNA. MORDOR tillåter både ligand- och receptorflexibilitet och använder en poängfunktion som uppskattar komplexens totala energi och består av flera termer (elektrostatisk, van der Waals, dihedral vinkel, torsionsvinkel, bindning och Urey−Bradley) [29]. rDock (tidigare: RiboDock) består av en stokastisk sökmotor för genetisk algoritm som en posegenerator och intermolekylär poängfunktion validerad mot protein- och RNA-mål [30,31]. Huvudkomponenten i denna poängfunktion är en van der Waals-potential, en empirisk term för attraktiva och frånstötande polära interaktioner, och en valfri desolvationspotential som kombinerar en vägd lösningsmedelstillgänglig ytarea. rDock-programmet kan också användas för att återskapa poser som genererats av ett externt verktyg.

I en portfölj av metoder som underlättar förutsägelse av 3D RNA-ligandstrukturer finns det också fristående poängfunktioner specifika för RNA-ligandkomplex, avsedda att användas för rescoring av modeller genererade genom molekylär dockning. En separat grupp av sådana metoder består av statistiska potentialer (statistiska poängfunktioner, eller kunskapsbaserade potentialer), som härleds från en analys av experimentellt lösta strukturer. Pfeffer och Gohlke utvecklade en poängfunktion som heter DrugScore RNA, som använder en avståndsberoende potential beräknad på basis av kontakter mellan ligand och receptoratomer [32]. Båda interagerande partnerna representerar alla atomer med hjälp av Tripos-atomtyper. På liknande sätt en KScore-poängfunktion, beskriven av Zhao et al., är också en avståndsberoende potential, som förutom standarduppsättningen av Tripos-atomtyper, använder en utökad atomtypuppsättning för att karakterisera metall-ligand- och vatten-ligand-interaktionerna bättre. Den definierar likaså ett speciellt atomtypningsschema för nukleinsyror, och det parametriserades på ligandkomplex med proteiner (2422 komplex), DNA (300 komplex) och RNA (97 komplex). Yan och Wang beskrev en avståndsberoende poängfunktion som kallas SPA-LN, där Tripos-atomtyper används för RNA- och liganderpresentation [33]. Under optimeringen av parametrar fokuserade de inte bara på att rekapitulera ligandens nästan naturliga ställning utan också på affinitetsuppskattningen. Att förbättra affinitetsförutsägelserna var ett mål för Chen et al., författare till funktionerna iMDLScore1 och iMDLScore2 [34]. De optimerade AutoDock4.1 poängtermer med hjälp av multilinjära regressionsmetoder och bindningsaffinitetsdata för 45 RNA-komplex. Vår grupp utvecklade LigandRNA - en anisotrop avstånds- och vinkelberoende statistisk potential [35]. Den härleddes från en diversifierad uppsättning av 251 experimentellt lösta RNA-ligandkomplex och använde representation av alla atomer med Tripos-atomtyper. Den visade sig vara överlägsen poängfunktioner som beskrivits tidigare i termer av noggrannhet för att hitta en nästan naturlig konformation av ligander. Chhabra et al. i RNAPosers använde ett avståndsberoende fingeravtryck för att beskriva en bindande pose av en ligand i RNA-bindande ficka [36]. Data härledda från 80 experimentellt lösta RNA-ligandkomplex användes för att träna en maskininlärningsalgoritm, som sedan användes för att rangordna dockningspositioner. På samma sätt som de program som beskrivs ovan använder RNAPosers en representation av alla atomer med Tripos-atomtyper.

I den här studien beskriver vi AnnapuRNA, en ny kunskapsbaserad poängfunktion utformad för att utvärdera RNA-ligandkomplexstrukturer, genererade av vilken beräkningsdockningsmetod som helst. Vi presenterar också ett riktmärke där vi jämför AnnapuRNA med andra tillgängliga poängfunktioner. Vi presenterar en fallstudie där vi använde molekylär dockning i kombination med AnnapuRNA-poängfunktionen för att förutsäga en nyligen publicerad struktur av en FMN-riboswitch samkristalliserad med en ny liten molekylhämmare. Vår metod förutspådde framgångsrikt strukturen av detta komplex baserat på den tidigare publicerade strukturen av FMN i komplex med en annan ligand, såväl som den lågupplösta apo-strukturen av detta RNA.

AnnapuRNA är fritt tillgängligt för det vetenskapliga samfundet på https://github.com/filipspl/AnnapuRNA.


En liten molekyl RAS-mimetik stör RAS-associationen med effektorproteiner för att blockera signalering

Onkogen aktivering av RAS-gener via punktmutationer förekommer i 20%-30% av humana cancerformer. Utvecklingen av effektiva RAS-hämmare har varit utmanande, vilket kräver nya metoder för att hämma detta onkogena protein. Funktionella studier har visat att switchregionen av RAS interagerar med ett stort antal effektorproteiner som innehåller en gemensam RAS-bindande domän (RBD). Eftersom RBD-medierade interaktioner är väsentliga för RAS-signalering, utgör blockering av RBD-association med små molekyler ett attraktivt terapeutiskt tillvägagångssätt. Här presenterar vi bevis för att rigosertib, en styryl-bensylsulfon, fungerar som en RAS-härmare och interagerar med RBD:erna av RAF-kinaser, vilket resulterar i deras oförmåga att binda till RAS, störning av RAF-aktivering och hämning av RAS-RAF. -MEK-väg. Vi finner också att ribosertib binder till RBDs av Ral-GDS och PI3Ks. Dessa resultat tyder på att rigosertibs inriktning av RBD över flera signalvägar kan representera en effektiv strategi för inaktivering av RAS-signalering.

Nyckelord: MAPK PI3K RAF RAS RAS-bindande domän rigosertib.

Copyright © 2016 Elsevier Inc. Alla rättigheter reserverade.

Siffror

Figur 1. Rigosertib binder till RBD:erna...

Figur 1. Rigosertib binder till RBD:erna för c-RAF och B-RAF

Figur 2. NMR-analys av B-RAF...

Figur 2. NMR-analys av B-RAF RBD-Rigosertib-interaktionen: studier av kemiska skiftstörningar och NMR...

Figur 3. Rigosertib interagerar med β1...

Figur 3. Rigosertib interagerar med β1-strängen, β2-strängen och α1-helixen i...

Figur 4. Rigosertib interfererar med tillväxtfaktorinducerad...

Figur 4. Rigosertib interfererar med tillväxtfaktorinducerad RAF-dimerisering och MEK/ERK-aktivering

Figur 5. Behandling av mänskliga tumörceller...

Figur 5. Behandling av mänskliga tumörceller med Rigosertib hämmar c-RAF Ser338-fosforylering och hämmar...

Figur 6. Rigosertib hämmar RAS-medierad transformation och...

Figur 6. Rigosertib hämmar RAS-medierad transformation och tumörtillväxt

(A) Rigosertib hämmar omvandling av kyckling...

Figur 7. Behandling med Rigosertib undertrycker...

Figur 7. Behandling med Rigosertib undertrycker tillväxten av RAS-driven pankreatisk intraepitelial neoplasi


Abstrakt

Ett alternativt tillvägagångssätt för att främja kristalliseringen av proteiner är att förbättra intermolekylära kontakter mellan makromolekyler eller att eliminera intermolekylära interaktioner eller interaktioner med lösningsmedel som kan hämma kristallisation. Platsspecifika mutationer har använts, liksom trunkering med genetiska eller proteolytiska medel. Det finns dock betydande problem. Eftersom strukturen av målmakromolekylen är okänd, kan det inte finnas någon bra grund för utformningen av mutanter eller trunkationer. Dessutom kräver tillvägagångssättet att proteinet produceras med rekombinant DNA-teknik, vilket ofta inte är fallet. Vi har försökt ta itu med dessa problem genom att initiera experiment baserade på två idéer. Den första är att en mängd olika konventionella små molekyler systematiskt kan introduceras i moderlutar under kristallisationsscreening. Genom inkorporering i kristallgittret kan de ytterligare intermolekylära interaktionerna som de små molekylerna tillhandahåller förbättra kristallkärnbildning och tillväxt. Ett andra tillvägagångssätt som vi eftersträvar är den kemiska modifieringen av olika aminosyrasidokedjor med hjälp av traditionell proteinkemi. Vi tror att i vissa fall kan kemiskt modifierade proteiner induceras att kristallisera eller kristallisera bättre än det naturliga proteinet.


En liten molekyl som riktar in sig på mutagen translesionssyntes förbättrar kemoterapi

Inneboende och förvärvad läkemedelsresistens och induktion av sekundära maligniteter begränsar framgångsrik kemoterapi. Eftersom mutagen translesionssyntes (TLS) bidrar till kemoresistens såväl som behandlingsinducerade mutationer, är inriktning på TLS en attraktiv väg för att förbättra kemoterapeutika. Utvecklingen av små molekyler med hög specificitet och in vivo-effekt för mutagen TLS har dock varit utmanande. Här rapporterar vi upptäckten av en liten molekylhämmare, JH-RE-06, som stör mutagen TLS genom att förhindra rekrytering av mutagen POL ζ. Anmärkningsvärt nog riktar JH-RE-06 sig på en nästan funktionslös yta av REV1 som interagerar med REV7-subenheten av POL ζ. Bindning av JH-RE-06 inducerar REV1-dimerisering, vilket blockerar REV1-REV7-interaktionen och POL ζ-rekryteringen. JH-RE-06 hämmar mutagen TLS och förstärker cisplatininducerad toxicitet i odlade human- och muscellinjer. Samtidig administrering av JH-RE-06 med cisplatin undertrycker tillväxten av xenograft humana melanom hos möss, vilket skapar ett ramverk för att utveckla TLS-hämmare som en ny klass av kemoterapiadjuvans.

Nyckelord: POL ζ REV1 REV7 kemoterapi kemoterapi cisplatintranslesionssyntes.

Copyright © 2019 Elsevier Inc. Med ensamrätt.

Uttalande av intressekonflikt

P.Z. och J.H. är uppfinnare av ett patent på JH-RE-06. De återstående författarna deklarerar inga konkurrerande intressen.

Siffror

Figur 1.. Upptäckt och karakterisering av JH-RE-06,...

Figur 1.. Upptäckt och karakterisering av JH-RE-06, en liten molekylhämmare som blockerar REV1...

Figur 2.. Strukturell och biokemisk karakterisering av...

Figur 2.. Strukturell och biokemisk karakterisering av cREV1 CTD/JH-RE-06-komplexet.

Figur 3.. JH-RE-06 förstärker cisplatins cytotoxicitet och...

Figur 3.. JH-RE-06 förstärker cisplatins cytotoxicitet och undertrycker cisplatininducerad mutagenes.

Celler behandlades med DMSO...

Figur 4.. JH-RE-06 sensibiliserar celler för cisplatin...

Figur 4.. JH-RE-06 sensibiliserar celler för cisplatin och reducerar HPRT-mutationer på ett REV1-beroende sätt.

Figur 5.. JH-RE-06 förbättrar tumörcellssvar...

Figur 5.. JH-RE-06 förbättrar tumörcellsvaret på cisplatin i en xenograft-musmodell.


Abstrakt

De cellulära processerna som ligger till grund för livet är orkestrerade av proteiner och deras interaktioner. Den associerade strukturella och dynamiska heterogeniteten, trots att den är nyckeln till funktion, utgör en grundläggande utmaning för befintliga analytiska och strukturella metoder. Vi använde interferometrisk spridningsmikroskopi för att kvantifiera massan av enstaka biomolekyler i lösning med 2% sekvensmassanoggrannhet, upp till 19 kilodaltons upplösning och 1 kilodaltons precision. Vi löste oligomera distributioner vid högt dynamiskt område, detekterade småmolekylbindning och massbildade proteiner med associerade lipider och sockerarter. Dessa förmågor gjorde det möjligt för oss att karakterisera den molekylära dynamiken i processer så olika som glykoproteintvärbindning, amyloidogen proteinaggregation och aktinpolymerisation. Interferometrisk spridningsmasspektrometri möjliggör spatiotemporalt upplöst mätning av ett brett spektrum av biomolekylära interaktioner, en molekyl i taget.

Biomolekylära interaktioner och sammansättningar är centrala för ett brett spektrum av fysiologiska och patologiska processer som spänner över längdskalor från små komplex (1) till mesoskalan (2, 3). Trots betydande utvecklingar inom tekniker som kan tillhandahålla högupplöst strukturell information (4), är sådana tekniker typiskt statiska, involverar medelvärdesberäkning över många molekyler i provet och fångar därför ofta inte helt mångfalden av strukturer och interaktioner. Lösningsbaserade ensemblemetoder möjliggör dynamiska studier men saknar upplösningen av separation som krävs för att särskilja olika arter (57). Enkelmolekylmetoder erbjuder ett sätt att kringgå heterogenitet i både struktur och dynamik, och framsteg har gjorts när det gäller att karakterisera interaktioner (8) och mekanismer (9, 10). Hittills har dock inget enmolekylärt tillvägagångssätt kunnat kvantifiera och följa mångfalden av interaktioner mellan biomolekyler med den erforderliga spatiotemporala noggrannheten och upplösningen.

Givet tillräcklig känslighet är ljusspridning ett idealiskt medel för att detektera och karakterisera molekyler i lågspridande in vitro-förhållanden på grund av dess universella tillämpbarhet. I ett interferometriskt detektionsschema (Fig. 1A) skalar spridningssignalen med polariserbarheten, som är en funktion av brytningsindex och proportionell mot partikelvolymen (11). Kombinera approximationen att enstaka aminosyror effektivt beter sig som enskilda nanoobjekt med observationen att de specifika volymerna av aminosyror och brytningsindex för proteiner endast varierar med

1 % (fig. S1 och tabell S1) tyder på att antalet aminosyror i en polypeptid, och därmed dess massa, är proportionella mot dess spridningssignal. Detta nära samband mellan massa och interferometrisk kontrast, som har förutspåtts (12, 13) och observerade (14, 15) att hålla grovt även på enkelmolekylnivå, skulle alltså i princip kunna användas för att uppnå hög massnoggrannhet.

(A) Schematisk beskrivning av det experimentella tillvägagångssättet som förlitar sig på immobilisering av individuella molekyler nära ett brytningsindexgränssnitt. Oligomera tillstånd är färgade olika för tydlighetens skull. (B) Differentiell interferometrisk spridningsbild av BSA. Skalstång, 0,5 μm. (C) Representativa bilder av monomerer (överst till vänster), dimerer (nedre till vänster), trimerer (överst till höger) och tetramerer (nederst till höger) av BSA. Skalstänger, 200 nm. (D) Scatterplot av enmolekylbindningshändelser och deras spridningskontraster för 12 nM BSA från 14 filmer (nedre panelen). Motsvarande histogram (n = 12 209) med en inzoomad vy av regionen för större arter (övre panelen). Minskningen av landningshastigheten är ett resultat av en minskning av BSA-koncentrationen med tiden på grund av det stora förhållandet mellan yta och volym hos vår provcell (tilläggsmaterial).

Bygger på de senaste framstegen inom det experimentella tillvägagångssättet (fig. S2) som förbättrade bildkontraster för interferometrisk spridningsmikroskopi (15, 16), kunde vi få högkvalitativa bilder av enstaka proteiner när de diffunderade från lösningen för att binda ospecifikt till mikroskopets täckglas/lösningsgränssnitt (Fig. 1, B och C och film S1). Att nå signal-brus-förhållanden >10, även för små proteiner som bovint serumalbumin (BSA), tillsammans med en optimerad dataanalysmetod (16), tillät oss att extrahera spridningskontrasten för varje molekylär bindningshändelse med hög precision (Fig. 1D och Fig. S3). Dessa data avslöjade tydliga signaturer av olika oligomera tillstånd av BSA, med relativa mängder för monomer till tetramer på 88,63, 9,94, 1,18 och 0,25% av de detekterade partiklarna. För ospecifik bindning till ett ofunktionaliserat mikroskoptäckglas var ytfästning effektivt irreversibel (12 209 bindningar mot 372 obindande händelser). Som ett resultat kunde vi bestämma (bulk) bindningshastighetskonstanter, som i allmänhet endast uppvisade små variationer med oligomert tillstånd. Dessa kunde tillgodoses för att erhålla mindre korrigeringar av de registrerade masspektra och ge lösningsfördelningen (fig. S4). Våra resultat, inklusive detektion och kvantifiering av sällsynta komplex som BSA-tetramerer, visar förmågan hos interferometrisk spridningsmasspektrometri (iSCAMS) för att karakterisera lösningsfördelningar av oligomera arter och molekylära komplex vid högt dynamiskt område.

Det regelbundna avståndet i kontrasthistogrammet för BSA bekräftar preliminärt den förväntade linjära skalningen mellan massa och interferometrisk kontrast. Upprepa dessa mätningar för åtta olika proteiner, som spänner över 53 till 803 kDa, validerar det linjära förhållandet (Fig. 2A och Fig. S5A). Avvikelsen mellan uppmätt och sekvensmassa var <5 kDa, vilket resulterade i ett medelfel på 1,9%, och denna avvikelse visade ingen detekterbar korrelation med brytningsförmågan i förhållande till molekylens övergripande form (fig. S6A). Även för stora strukturella skillnader, såsom de mellan de förlängda och vikta konformationerna av myosin med glatt muskulatur (530,6 kDa Fig. 2A och Fig. S5B och S7), hittade vi inte mätbara skillnader i den skenbara molekylmassan utöver den förväntade ökningen för tillsatsen av glutaraldehydmolekyler som används för att tvärbinda myosin till den vikta konformationen (förlängd, 528,4 ± 16,2 kDa vikt, 579,4 ± 14,8 kDa fig. S5B). Upplösningen, som definieras av den fulla bredden vid halva maximivärdet av den uppmätta kontrasten, nådde 19 kDa för streptavidin. I samtliga fall begränsades upplösningen av fotonskottsbrus och påverkades av molekylmassa, ökande från 19 kDa för streptavidin till 102 kDa för tyroglobulin (fig. S6, B och C). <0,5% avvikelse från sekvensmassa för arter på >100 kDa jämför väl med naturlig masspektrometri (17) och visar den inneboende användbarheten av iSCAMS för noggrann massmätning av biomolekyler med oligomer upplösning.

(A) Kontrast mot molekylmassa, inklusive för proteiner som används för masskalibrering (svart), karakterisering av formberoende (gul), protein-ligandbindning (grön), lipidnanodisksammansättning (röd) och glykosylering (blå). Massfel (övre panel) ges som en procentandel av sekvensmassan i förhållande till den givna linjära passningen. (B) Nanodisk massmätning för olika lipidsammansättningar och proteinbälten. Massor erhållna med alternativa metoder för MSP1D1/DMPC markeras och extrapoleras till de andra kompositionerna. De horisontella staplarna anger det förväntade massaintervallet som en funktion av karakteriseringstekniken, där de tunna staplarna indikerar den uppmätta kontrasten och de tjocka staplarna representerar mätosäkerheten i termer av standardfelet för medelvärdet (SEM) för upprepade experiment. För varje prov betecknar den övre texten membranställningsproteinet (MSP) som används, och den nedre texten indikerar lipiderna i nanodisken. (C) Registrerad differentiell kontrast för Env uttryckt i närvaro eller frånvaro av kifunensin och associerade massintervall som förväntas för olika glykosyleringsnivåer. (D) Masskänslig detektion av ligandbindning i biotin-streptavidinsystemet, enligt sekvensmassan av streptavidin och massorna av biotin och två biotinylerade peptider i förhållande till kalibreringen erhållen från (A). Förkortningar definieras i tabell S8. I (A) och (D) representerar felstaplar SEM.

När man går bortom arter som enbart består av aminosyror, är lipidnanoskivor ett idealiskt system för att testa den breda tillämpbarheten av iSCAMS på grund av deras flexibilitet när det gäller polypeptid- och lipidinnehåll (18). För nanoskivor som består av MSP1D1-bandproteinet och DMPC (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfokolin) lipider, fick vi en massa på 141,0 ± 1,6 kDa, i god överensstämmelse med intervallet av massor som spänner över 124 till 158 kDa rapporterade från andra metoder (Fig. 2B och Fig. S5D). Genom att ersätta MSP1D1 med den mindre MSP1ΔH5 minskade nanodiskens diameter och lipidhalten med

20 %, efter att ha tagit hänsyn till proteinbältets tjocklek (19). Med tanke på massorna av MSP1D1 och MSP1ΔH5 (47 respektive 42 kDa), förutspådde vi en massa för MSP1ΔH5 nanoskivan på 113,6 kDa, i utmärkt överensstämmelse med vår mätning (114,1 ± 1,9 kDa). Massförskjutningar associerade med förändringar i lipidsammansättningen, såsom de som introducerades av delvis omättade lipider och kolesterol, matchade de som förutspåddes från monteringsförhållandena (Fig. 2B och tabellerna S2 till S6).

För att se om vårt tillvägagångssätt också gäller för lösningsmedelsexponerade delar som upplever en annan dielektrisk miljö än de som är begravda i ett protein, valde vi HIV-höljesglykoproteinkomplexet (Env), som är en trimer av gp41-gp120-heterodimerer. Env är i stor utsträckning N-glykosylerad, med kolhydraterna som bidrar med nästan hälften av dess massa (20). För en Env-trimermimik uttryckt i närvaro av kifunensine, en mannosidashämmare som huvudsakligen leder till obearbetad människa9GlcNAc2 glykaner (Man, mannos GlcNAc, N-acetylglukosamin) (fig. S8), registrerade vi en massa på 350,0 ± 5,7 kDa. Om man gör den grova approximationen att glykaner och aminosyror har liknande polarisationsförmåga, motsvarar detta en glykanbeläggning på 74 ± 3 av 84 möjliga platser (fig. 2C och fig. S5E), i överensstämmelse med nyliga observationer av hög beläggning för gp120 uttryckt med kifunensine (21). För Env uttryckt utan kifunensine, registrerade vi en lägre massa på 315,3 ± 10,5 kDa. Massskillnaden kan endast delvis hänföras till den lägre medelmassan av de bearbetade glykanerna (fig. S8) och ger en total N-glykanbeläggning på 61 ± 6. Även om de exakta värdena för beläggning beror på vår kalibrering (Fig. 2A), överensstämmer förekomsten av obebodda platser med deras observationer i proteomikdata (22).

Den höga precisionen på 1,8 ± 0,5% med avseende på proteinmassan (Fig. 2A) indikerar potentialen för direkt detektion av småmolekylers bindning. För att undersöka de nuvarande gränserna för iSCAMS när det gäller precision undersökte vi därför biotin-streptavidinsystemet (Fig. 2D och Fig. S5C). Vi mätte massor för streptavidin i frånvaro (55,7 ± 1,1 kDa) och närvaro (57,4 ± 0,9 kDa) av biotin, och fann en skillnad på 1,7 ± 1,4 kDa, i god överensstämmelse med de förväntade 0,98 kDa för fullständig ockupation av de fyra bindningsställena . Vid tillsats av två olika biotinylerade peptider (3705,9 och 4767,4 Da) fann vi ökningar på 16,1 ± 2,8 och 22,0 ± 2,2 kDa (jämfört med förväntade 14,8 och 19,1 kDa) (Fig. 2D och Fig. S5C). Dessa data visar att iSCAMS kan detektera associationen av kilodaltonstora ligander, vilket visar dess lämplighet för känsliga ligandbindande studier i lösning.

Efter att ha etablerat funktionerna hos iSCAMS försökte vi testa det på mer komplexa system som är svåra att bedöma kvantitativt med befintliga tekniker som en konsekvens av heterogenitet och flerstegsmonteringsmekanismer (Fig. 3). Dessutom syftade vi till att övervaka kärnbildnings- och polymerisationsdynamik för mesoskopiska strukturer ner till enkelmolekylnivå, vilket är utmanande på grund av det samtidiga kravet på högt dynamiskt omfång, hög bildhastighet och direkt korrelation mellan de observerade signalerna och den associerade molekylen evenemang. Biotin-streptavidin-systemet uppvisar nästan kovalent bindning, vilket väcker frågan om iSCAMS är kapabel att inte bara bestämma massfördelningar, utan också att kvantifiera svagare jämvikter, som ofta påträffas för protein-protein-interaktioner.

(A) Massfördelningar för Env i närvaro av 0,5 till 40 nM BanLec-monomer, tillsammans med förväntade positioner för multiplar av bundna BanLec-tetramerer. Infälld, en inzoomad vy av regionen för större arter. (B) Oligomera fraktioner färgade enligt (A) kontra BanLec-koncentration, inklusive förutsägelser (kurvor) med användning av den visade modellen.

Vi undersökte därför interaktionen av Env med det antivirala lektinet BanLec, som neutraliserar HIV genom att binda till ytan N-glykaner (23, 24) genom en okänd mekanism. Vi kunde övervaka interaktioner och kortlivade komplex före aggregering, med tillägg av BanLec till Env vilket resulterade i en minskning av enstaka Env-enheter kopplade till utseendet av dimerer och högre ordningens sammansättningar (Fig. 3A). Att beskriva den experimentella oligomera evolutionen med en enkel modell (Fig. 3B) gjorde det möjligt för oss att extrahera de underliggande associationskonstanterna [KBanLec = 0,12 nM-1 KEnv = 8 nM -1 KBanLec = 0,4 nM -1 (enligt definition i Fig. 3B)], i god överensstämmelse med nyare bulkstudier (KBanLec = 0,19 nM −1 ), som också hittade signaturer för en sekundär bindningshändelse (2,85 nM −1 ) (25). Vår förmåga att följa och modellera utvecklingen av olika oligomera arter tillät oss att extrahera interaktionsmekanismen och den energi som ligger till grund för lektin-glykoprotein-interaktionen, trots heterogeniteten i detta multikomponentsystem. Som ett resultat kan vi visa att bindning av Env till BanLec som redan är bunden till Env (KEnv) är mycket starkare än att frigöra BanLec (KBanLec), en nyckelegenskap för kooperativt beteende. Dessutom gjorde massupplösningen av vårt tillvägagångssätt det möjligt för oss att kvantifiera antalet BanLecs bundna per dimer (en till två), trimer (två till tre) och tetramer (tre till fyra) av Env, vilket visar bivalent bindning. Dessa resultat är direkt relevanta för karakterisering och optimering av antiretrovirala medel, med tanke på att multivalens och aggregering har föreslagits vara kopplade till neutraliseringsstyrka (25). Vi förväntar oss att liknande kvantitativa insikter kan uppnås för andra terapeutiska målproteiner och protein-proteininteraktioner i allmänhet.

En fördel med vårt avbildningsbaserade tillvägagångssätt är dess förmåga att tidslösa massförändringar på ett positions- och lokalkoncentrationskänsligt sätt. Detta gör det möjligt för oss att undersöka ytkatalyserade kärnbildningshändelser som så småningom kan leda till amyloidbildning (26). Tidigare studier med fluorescensmärkning fann aggregat av

0,6 μm i diameter inom en minut efter tillsats av det amyloidogena proteinet α-synuklein vid 10 μM till ett lämpligt laddat dubbelskikt (27). Vid tillsats av α-synuklein till en plan, negativt laddad DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin)/DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- l -serine) (3:1) membrane at physiological pH, we observed the appearance and growth of nanoscopic objects within seconds, even at low micromolar concentrations (Fig. 4A and movie S2). We were unable to determine the sizes of the initial nucleating species or individual assembly steps owing to the low molecular mass of α-synuclein (14 kDa), but we could monitor the nanoscale formation of associated structures in the range of hundreds of kilodaltons and determine the kinetics (Fig. 4B). Growth of these clusters was uniform across the field of view, with the initial rates following expectations for a first-order process (Fig. 4B and fig. S9A), pointing to a simple growth mechanism. We did not detect such structures on neutral, DOPC-only bilayers, and we found evidence for thioflavin T–positive aggregates after overnight incubation (fig. S9B), suggesting that our assay probes early stages of amyloid assembly.

(A) Schematic and iSCAMS images of α-synuclein (1 μM) aggregation on a negatively charged bilayer membrane. (B) Initial growth rate versus α-synuclein concentration, shown with the best fit assuming first-order kinetics. Error bars denote SEM for different particles. Inset, individual (gray) and average (black) growth trajectories for 21 particles from (A). (C) Schematic and iSCAMS images of actin polymerization. The arrow highlights a growing filament. (D) Representative traces of actin filament tip position (gray) and corresponding detected steps (black). (E) Step and mass histogram from 1523 steps and 33 filaments, including a fit to a Gaussian mixture model (black) and individual contributions (colored according to fig. S10G). Scale bars, 1 μm. In these experiments, background correction involved removal of the static background before acquisition, rather than continuous differential imaging as in Figs. 2 and 3 (supplementary materials).

At the extremes of its current sensitivity, iSCAMS enables mass imaging of mesoscopic self-assembly, molecule by molecule. In an actin polymerization assay, subtraction of the constant background revealed the growth of surface-immobilized filaments. In contrast to α-synuclein, where the growth of interest took place within a diffraction-limited spot, in this case we could quantify length changes of filaments larger than the diffraction limit upon the attachment and detachment of actin subunits (Fig. 4C, fig. S10C, and movie S3). We observed distinct, stepwise changes in the filament length (Fig. 4D fig. S10, D to F and movie S4), the most frequent forward and backward step sizes in the traces being 3.0 ± 0.8 and 2.7 ± 0.7 nm, respectively—very close to the expected length increase of 2.7 nm upon binding of a single actin subunit to a filament (Fig. 4E). Detection of larger step sizes represents the addition of multiple actin subunits within our detection time window. The contrast changes associated with the different step sizes corresponded to mass changes of one, two, or three actin monomers binding to (and unbinding from) the tip of the growing filaments during acquisition (fig. S10, G and H). Even though we cannot yet distinguish between models invoking monomer (28) or oligomer (29) addition to a growing filament at the current level of spatiotemporal resolution, these results demonstrate the capability of iSCAMS to quantitatively image mesoscopic dynamics and determine how they are influenced by associated proteins at the single-molecule level.

We anticipate that combining iSCAMS with established surface modifications (30) will dramatically expand its capabilities. Passivation decreases surface binding probabilities and thereby should provide access to much higher analyte concentrations (greater than micromolar), and surface activation will reduce measurement times at low concentrations (less than nanomolar). Specific functionalization and immobilization of individual subunits or binding partners could allow for the determination of on and off rates, in addition to equilibrium constants, and enable targeted detection in the presence of other analytes (14). Although studies within complex three-dimensional environments such as the cell may prove to be beyond reach, the advances reported here will make iSCAMS a key approach for dynamic in vitro studies of biomolecular interactions, assembly, and structure at the single-molecule level.


ADVICE ON EXPERIMENTAL DESIGN

An ideal binding experiment has a fixed total concentration of one of the two reactants, let's choose A, that is lower than the Kd. Ten-fold lower than the Kd är bra. Using a low concentration of total A simplifies the execution of the experiment and interpretation of the data, because essentially all of the other reactant B is free under all conditions. The practical limitation is that the assay must be able to measure the concentration of free or bound A.

If one chooses a low concentration of total A, then the experiment is to determine the extent of the reaction over a wide range of concentrations of B. When the concentration of B is below the Kd, most of B is free, because, given the low concentrations of both reactants, little binding will occur. At higher concentrations of B more AB forms, but the concentration of A is so low that virtually all of B is free. Because most of B is free both below and above the Kd, Bfri ∼ Btotal one does not have to compensate for any B bound to A when analyzing the data.

If the assay lacks the sensitivity to do the experiment with a concentration of A below the Kd, then use the lowest practical concentration of A. Later, when analyzing the data (see below), compensate for the finite amount of B bound to A at each concentration of total B in the sample.


Binding a Macromolecule M with a Small Molecule L - Biology

The multiple equilibria for the binding of a ligand A by a macromolecule P with n binding sites may be formulated in terms of a stoichiometric analysis or on the basis of a site-oriented scrutiny. The dependence of binding on ligand concentration can always be correlated in terms of n stoichiometric binding constants,Ki, even if there are interactions between sites that accentuate or attenuate binding affinities. A corresponding correlation in terms of site binding constants, kj, under the most general circumstances depends on the definition of n2n-1 different constants of which 2n-1 are independent. If experimental data are correlated in terms of n parameters kalpha, kbeta . klambda in an equation of the site-binding form, (see article for formular) then there is no guarantee that the values of ka, kb, etc., have any unique relationships to site binging constants. Examples are given to illustrate this point. Equation are derived for relating stoichiometric binding constants to site binding constants, for the general case and for various special circumstances. These equations make it possible to define and analyze binding insystems with interactions and conformational accommodations. Accordingly, a graphical procedure is described (in which iKi is plotted against i, the stoichiometric binding step) that provides an affinity profile for concise representation of magnitudes of binding constants and for detecting interactions that accentuate or attenuate site binding affinities.


Titta på videon: Аржаков М. С. - Высокомолекулярные соединения - Параметры, описывающие макромолекулу (Augusti 2022).