Information

5A: Introduktion till reversibel bindning - biologi

5A: Introduktion till reversibel bindning - biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Lärandemål

  • skriv ekvationer för dissociationskonstanten (KD), massbalansen för total makromolekyl (M0), total ligand (L0) och [ML] som en funktion av L eller Lo ([ML] = [M0][L]/(KD+ [L]) (när Lo >> Mo eller när fri [L] är känd) och Y = fraktionerad mättnad = Y = ([ML]/[M0] = [L]/(KD+ [L])
  • bestäm vilken av två givna ekvationer för [ML] som ska användas under förhållanden när ovanstående villkor för L0 och L är givna
  • baserat på ekvationen ([ML] = [M0][L]/(KD+ [L]) rita kvalitativa grafer för olika givna L0-, L- och Kd-värden
  • bestämma fraktionsmättnad givna relativa värden på Kd och L, med antagande av L0 >> M0
  • jämför relativ % bunden för kovalent bindning av protoner till en syra och icke-kovalent bindning av en ligand till en makromolekyl givna pka/pH och Kd/L värden
  • beskriva skillnader i bindningskurvor för bindning av en ligand till en makromolekyl och dimerisering av en makromolekyl
  • härleda en ekvation som visar sambanden mellan hastighetskonstanten för bindning (kon), dissociation (koff) och den termodynamiska dissociationen (Kd) eller jämviktskonstanten (Keq).
  • beskriva de strukturella och matematiska skillnaderna mellan specifik och ospecifik bindning
  • givet ett Kd, uppskatta t1/2-värden för ML-komplexets livstid.
  • beskriva tekniker som används för att bestämma ML för givna L- eller L0-värden, inklusive de som gör och inte kräver separation av ML från M, så att Kd-värden för en M- och L-interaktion kan bestämmas
  • Lista fördelarna med isotermisk titreringskalorimetri och ytplasmonresonans vid bestämning av bindningsinteraktionsparametrar

Cis-reglerande element

Cis-reglerande element (CREs) eller Cis-regleringsmoduler (CRM) är regioner av icke-kodande DNA som reglerar transkriptionen av närliggande gener. CRE är viktiga komponenter i genetiska regulatoriska nätverk, som i sin tur kontrollerar morfogenes, utvecklingen av anatomi och andra aspekter av embryonal utveckling, studerade i evolutionär utvecklingsbiologi.

CRE finns i närheten av de gener som de reglerar. CRE reglerar vanligtvis gentranskription genom att binda till transkriptionsfaktorer. En enda transkriptionsfaktor kan binda till många CRE och därmed kontrollera uttrycket av många gener (pleiotropi). Det latinska prefixet cis betyder "på denna sida", dvs på samma DNA-molekyl som genen/generna som ska transkriberas.

CRM är DNA-sträckor, vanligtvis 100–1000 DNA-baspar långa, [1] där ett antal transkriptionsfaktorer kan binda och reglera uttryck av närliggande gener och reglera deras transkriptionshastigheter. De är märkta som cis eftersom de vanligtvis är belägna på samma DNA-sträng som generna de kontrollerar i motsats till trans, vilket hänvisar till effekter på gener som inte finns på samma sträng eller längre bort, såsom transkriptionsfaktorer. [1 ett cis-regulatoriskt element kan reglera flera gener, [2] och omvänt kan en gen ha flera cis-regleringsmoduler. [3] Cis-regulatoriska moduler utför sin funktion genom att integrera de aktiva transkriptionsfaktorerna och de associerade kofaktorerna vid en specifik tidpunkt och plats i cellen där denna information läses och en utdata ges. [4]

CRE är ofta men inte alltid uppströms om transkriptionsplatsen. CRE står i kontrast till trans-regulatoriska element (TRE). TREs kodar för transkriptionsfaktorer. [ citat behövs ]


Innehåll

Bindning av en ligand till ett bindningsställe på protein utlöser ofta en förändring i konformationen i proteinet och resulterar i förändrad cellulär funktion. Därför är bindningsställe på protein kritiska delar av signaltransduktionsvägar. [10] Typer av ligander inkluderar neurotransmittorer, toxiner, neuropeptider och steroidhormoner. [11] Bindningsställen ådrar sig funktionella förändringar i ett antal sammanhang, inklusive enzymkatalys, molekylär signalering, homeostatisk reglering och fysiologisk funktion. Elektrisk laddning, sterisk form och geometri hos platsen möjliggör selektivt för mycket specifika ligander att binda, vilket aktiverar en speciell kaskad av cellulära interaktioner som proteinet är ansvarigt för. [12] [13]

Katalysredigering

Enzymer åstadkommer katalys genom att binda starkare till övergångstillstånd än substrat och produkter. Vid det katalytiska bindningsstället kan flera olika interaktioner verka på substratet. Dessa sträcker sig från elektrisk katalys, syra- och baskatalys, kovalent katalys och metalljonkatalys. [11] Dessa interaktioner minskar aktiveringsenergin för en kemisk reaktion genom att tillhandahålla gynnsamma interaktioner för att stabilisera högenergimolekylen. Enzymbindning möjliggör närmare närhet och uteslutning av ämnen som är irrelevanta för reaktionen. Sidereaktioner avskräcks också av denna specifika bindning. [14] [11]

Typer av enzymer som kan utföra dessa åtgärder inkluderar oxidoreduktaser, transferaser, hydrolaser, lyaser, isomeraser och ligaser. [15]

Till exempel katalyserar transferashexokinaset fosforyleringen av glukos för att göra glukos-6-fosfat. Rester av hexokinas på det aktiva stället möjliggör stabilisering av glukosmolekylen på det aktiva stället och sporrar uppkomsten av en alternativ väg med gynnsamma interaktioner, vilket minskar aktiveringsenergin. [16]

Inhibition Edit

Proteininhibering genom inhibitorbindning kan inducera obstruktion i vägreglering, homeostatisk reglering och fysiologisk funktion.

Kompetitiva inhibitorer tävlar med substrat för att binda till fria enzymer vid aktiva ställen och hindrar således produktionen av enzym-substratkomplexet vid bindning. Till exempel orsakas kolmonoxidförgiftning av den konkurrenskraftiga bindningen av kolmonoxid i motsats till syre i hemoglobin.

Icke-kompetitiva inhibitorer binder alternativt samtidigt med substrat vid aktiva ställen. Vid bindning till ett enzymsubstrat (ES)-komplex bildas ett enzymsubstratinhibitor (ESI)-komplex. I likhet med konkurrerande inhibitorer minskas också hastigheten vid produktbildning. [5]

Slutligen kan blandade inhibitorer binda till både det fria enzymet och enzym-substratkomplexet. Men i motsats till kompetitiva och icke-kompetitiva hämmare binder blandade hämmare till det allosteriska stället. Allosterisk bindning inducerar konformationsförändringar som kan öka proteinets affinitet för substrat. Detta fenomen kallas positiv modulering. Omvänt är allosterisk bindning som minskar proteinets affinitet för substrat negativ modulering. [17]

Aktiv webbplats Redigera

På det aktiva stället binder ett substrat till ett enzym för att inducera en kemisk reaktion. [18] [19] Substrat, övergångstillstånd och produkter kan binda till det aktiva stället, såväl som alla konkurrerande hämmare. [18] Till exempel, i samband med proteinfunktion, kan bindningen av kalcium till troponin i muskelceller inducera en konformationsförändring i troponin. Detta gör det möjligt för tropomyosin att exponera aktin-myosin-bindningsstället till vilket myosinhuvudet binder för att bilda en tvärbrygga och inducera en muskelkontraktion. [20]

I samband med blodet är ett exempel på kompetitiv bindning kolmonoxid som konkurrerar med syre om det aktiva stället på hem. Kolmonoxids höga affinitet kan konkurrera ut syre i närvaro av låg syrekoncentration. Under dessa omständigheter inducerar bindningen av kolmonoxid en konformationsförändring som avskräcker hem från att binda till syre, vilket resulterar i kolmonoxidförgiftning. [5]

Allosterisk webbplats Redigera

Vid det regulatoriska stället kan bindningen av en ligand framkalla amplifierad eller hämmad proteinfunktion. [5] [21] Bindningen av en ligand till ett allosteriskt ställe av ett multimert enzym inducerar ofta positiv kooperativitet, det vill säga bindningen av ett substrat inducerar en gynnsam konformationsförändring och ökar enzymets sannolikhet att binda till ett andra substrat. [22] Regulatory site-ligander kan involvera homotropa och heterotropa ligander, där enstaka eller flera typer av molekyler påverkar enzymaktiviteten. [23]

Enzymer som är mycket reglerade är ofta viktiga i metabola vägar. Till exempel är fosfofruktokinas (PFK), som fosforylerar fruktos i glykolys, till stor del reglerat av ATP. Dess reglering i glykolys är absolut nödvändigt eftersom det är det bindande och hastighetsbegränsande steget i vägen. PFK kontrollerar också mängden glukos som avses att bilda ATP genom den katabola vägen. Därför, vid tillräckliga nivåer av ATP, hämmas PFK allosteriskt av ATP. Denna reglering bevarar effektivt glukosreserver, som kan behövas för andra vägar. Citrat, en mellanprodukt i citronsyracykeln, fungerar också som en allosterisk regulator av PFK. [23] [24]

Enkel- och flerkedjiga bindningsställen Redigera

Bindningsplatser kan också kännetecknas av sina strukturella egenskaper. Enkelkedjiga ställen (av "monodesmiska" ligander, μόνος: enkel, δεσμός: bindning) bildas av en enda proteinkedja, medan flerkedjeställen (av "polydemiska" ligander, πολοί: många) [25] är frekventa i protein komplex, och bildas av ligander som binder mer än en proteinkedja, typiskt i eller nära proteingränssnitt. Ny forskning visar att bindningsställets struktur har djupgående konsekvenser för proteinkomplexens biologi (utveckling av funktion, allosteri). [26] [ 27]

Kryptiska bindningsplatser Redigera

Kryptiska bindningsställen är de bindningsställen som övergående bildas i en apo-form eller som induceras av ligandbindning. Med tanke på de kryptiska bindningsställena ökar storleken på det potentiellt "drogbara" mänskliga proteomet från

78 % av sjukdomsassocierade proteiner. [28] Bindningsställena har undersökts av: stödvektormaskin applicerad på "CryptoSite"-datauppsättning, [28] Förlängning av "CryptoSite"-datauppsättning, [29] molekylär dynamiksimulering med lång tidsskala med Markov-tillståndsmodell och med biofysiska experiment, [30] och index för kryptiska webbplatser som är baserat på relativ tillgänglig yta. [31]

Bindningskurvor beskriver bindningsbeteendet av ligand till ett protein. Kurvor kan karakteriseras av sin form, sigmoidal eller hyperbolisk, som återspeglar huruvida proteinet uppvisar samverkande respektive icke-samverkande bindningsbeteende. [32] Typiskt beskriver x-axeln koncentrationen av ligand och y-axeln beskriver fraktionerad mättnad av ligander bundna till alla tillgängliga bindningsställen. [5] Michaelis Mentens ekvation används vanligtvis när man bestämmer kurvans form. Michaelis Mentens ekvation härleds baserat på steady-state-förhållanden och redogör för de enzymreaktioner som äger rum i en lösning. Men när reaktionen sker medan enzymet är bundet till ett substrat, spelar kinetiken ut annorlunda. [33]

Modellering med bindningskurvor är användbara när man utvärderar bindningsaffiniteterna för syre till hemoglobin och myoglobin i blodet. Hemoglobin, som har fyra hemgrupper, uppvisar kooperativ bindning. Detta betyder att bindningen av syre till en hemgrupp på hemoglobin inducerar en gynnsam konformationsförändring som möjliggör ökad bindningsgynnsamhet för syre för nästa hemgrupper. Under dessa omständigheter kommer bindningskurvan för hemoglobin att vara sigmoidal på grund av dess ökade gynnsamma bindning för syre. Eftersom myoglobin bara har en hemgrupp, uppvisar det icke-samverkande bindning som är hyperbolisk på en bindningskurva. [34]

Biokemiska skillnader mellan olika organismer och människor är användbara för läkemedelsutveckling. Till exempel dödar penicillin bakteriella enzymer genom att hämma DD-transpeptidas, förstöra utvecklingen av bakteriecellväggen och inducera celldöd. Således är studiet av bindningsställen relevant för många forskningsområden, inklusive cancermekanismer, [35] läkemedelsformulering [36] och fysiologisk reglering. [37] Formuleringen av en inhibitor för att dämpa ett proteins funktion är en vanlig form av farmaceutisk terapi. [38]

Inom ramen för cancer används ligander som är redigerade för att ha ett liknande utseende som den naturliga liganden för att hämma tumörtillväxt. Metotrexat, ett kemoterapeutikum, verkar till exempel som en kompetitiv hämmare vid det aktiva stället för dihydrofolatreduktas. [39] Denna interaktion hämmar syntesen av tetrahydrofolat, vilket stänger av produktionen av DNA, RNA och proteiner. [39] Hämning av denna funktion undertrycker neoplastisk tillväxt och förbättrar svår psoriasis och reumatoid artrit hos vuxna. [38]

Vid hjärt-kärlsjukdomar används läkemedel som betablockerare för att behandla patienter med högt blodtryck. Betablockerare (β-blockerare) är antihypertensiva medel som blockerar bindningen av hormonerna adrenalin och noradrenalin till β1- och β2-receptorer i hjärtat och blodkärlen. Dessa receptorer förmedlar normalt det sympatiska "fight or flight"-svaret, vilket orsakar sammandragning av blodkärlen. [40]

Konkurrenskraftiga inhibitorer finns också till stor del kommersiellt. Botulinumtoxin, kommersiellt känt som Botox, är ett neurotoxin som orsakar slapp förlamning i muskeln på grund av bindning till acetylkolinberoende nerver. Denna interaktion hämmar muskelsammandragningar, vilket ger utseendet av glatt muskulatur. [41]

Ett antal beräkningsverktyg har utvecklats för att förutsäga placeringen av bindningsställen på proteiner. [21] [42] [43] Dessa kan brett klassificeras i sekvensbaserade eller strukturbaserade. [43] Sekvensbaserade metoder förlitar sig på antagandet att sekvenserna av funktionellt konserverade delar av proteiner såsom bindningsställe är konserverade. Strukturbaserade metoder kräver proteinets 3D-struktur. Dessa metoder kan i sin tur delas in i mall- och fickbaserade metoder. [43] Mallbaserade metoder söker efter 3D-likheter mellan målproteinet och proteiner med kända bindningsställen. De fickbaserade metoderna söker efter konkava ytor eller nedgrävda fickor i målproteinet som har egenskaper som hydrofobicitet och vätebindningskapacitet som skulle tillåta dem att binda ligander med hög affinitet. [43] Även om termen pocket används här, kan liknande metoder användas för att förutsäga bindningsställen som används i protein-protein-interaktioner som vanligtvis är mer plana, inte i fickor. [44]


Innehåll

Typer av reversibla inhibitorer Redigera

Reversibla inhibitorer fäster till enzymer med icke-kovalenta interaktioner såsom vätebindningar, hydrofoba interaktioner och jonbindningar. Flera svaga bindningar mellan inhibitorn och det aktiva stället kombineras för att producera stark och specifik bindning. I motsats till substrat och irreversibla inhibitorer genomgår reversibla inhibitorer i allmänhet inte kemiska reaktioner när de binds till enzymet och kan lätt avlägsnas genom utspädning eller dialys.

Det finns fyra typer av reversibla enzymhämmare. De klassificeras efter effekten av att variera koncentrationen av enzymets substrat på inhibitorn. [3] [4] [1]

  • I konkurrenshämning, substratet och inhibitorn kan inte binda till enzymet samtidigt, som visas i figuren till höger. Detta beror vanligtvis på att inhibitorn har en affinitet för det aktiva stället för ett enzym där substratet också binder substratet och inhibitorn konkurrera för åtkomst till enzymets aktiva plats. Denna typ av hämning kan övervinnas genom tillräckligt höga koncentrationer av substrat (Vmax förblir konstant), dvs genom att konkurrera ut hämmaren. Däremot den skenbara Km kommer att öka när det krävs en högre koncentration av substratet för att nå Km punkt eller halva Vmax. Konkurrensinhibitorer liknar ofta i strukturen det verkliga substratet (se exempel nedan).
  • I okonkurrenskraftig hämning, binder hämmaren endast till substrat-enzymkomplexet. Denna typ av hämning orsakar Vmax att minska (maximal hastighet minskar som ett resultat av att aktiverat komplex avlägsnas) och Km att minska (på grund av bättre bindningseffektivitet som ett resultat av Le Chateliers princip och den effektiva elimineringen av ES-komplexet, vilket därmed minskar Km vilket indikerar en högre bindningsaffinitet).
  • I icke-konkurrensmässig hämning, reducerar bindningen av inhibitorn till enzymet dess aktivitet men påverkar inte bindningen av substrat. Som ett resultat beror graden av inhibering endast på koncentrationen av inhibitorn. Vmax kommer att minska på grund av oförmågan för reaktionen att fortgå lika effektivt, men Km kommer att förbli densamma eftersom själva bindningen av substratet, per definition, fortfarande kommer att fungera korrekt.
  • I blandad hämning, kan hämmaren binda till enzymet samtidigt som enzymets substrat. Bindningen av inhibitorn påverkar emellertid bindningen av substratet och vice versa. Denna typ av hämning kan reduceras, men inte övervinnas genom ökande koncentrationer av substrat. Även om det är möjligt för inhibitorer av blandad typ att binda på det aktiva stället, resulterar denna typ av hämning i allmänhet från en allosterisk effekt där inhibitorn binder till ett annat ställe på ett enzym. Inhibitorbindning till detta allosteriska ställe ändrar konformationen (d.v.s. tertiär struktur eller tredimensionell form) av enzymet så att substratets affinitet för det aktiva stället reduceras.

Dessa typer kan också särskiljas genom effekten av att öka substratkoncentrationen [S] på graden av inhibering orsakad av en given mängd inhibitor. För kompetitiv hämning reduceras graden av hämning genom att öka [S], för icke-kompetitiv hämning är hämningsgraden oförändrad, och för icke-kompetitiv (även kallad konkurrenshämmande) hämning ökar hämningsgraden med [S]. [6]

Kvantitativ beskrivning av reversibel hämning Redigera

Reversibel hämning kan beskrivas kvantitativt i termer av inhibitorns bindning till enzymet och till enzym-substratkomplexet, och dess effekter på enzymets kinetiska konstanter. I det klassiska Michaelis-Menten-schemat nedan binder ett enzym (E) till sitt substrat (S) för att bilda enzym-substratkomplexet ES. Vid katalys bryts detta komplex ned för att frigöra produkt P och fritt enzym. Inhibitorn (I) kan binda till antingen E eller ES med dissociationskonstanterna Ki eller Ki', respektive.

  • Konkurrenskraftiga hämmare kan binda till E, men inte till ES. Konkurrenshämningen ökar Km (dvs inhibitorn stör substratbindningen), men påverkar inte Vmax (hämmaren hindrar inte katalys i ES eftersom den inte kan binda till ES).
  • Icke-kompetitiva hämmare binder till ES. Okonkurrensmässig hämning minskar båda Km' och 'Vmax. Hämmaren påverkar substratbindningen genom att öka enzymets affinitet för substratet (minskande Km) samt hämmar katalys (minskar Vmax).
  • Icke-konkurrerande hämmare har identiska affiniteter för E och ES (Ki = Ki'). Icke-konkurrensmässig hämning förändras inte Km (dvs det påverkar inte substratbindningen) men minskar Vmax (d.v.s. inhibitorbindning hämmar katalys).
  • Inhibitorer av blandad typ binder till både E och ES, men deras affinitet för dessa två former av enzymet är olika (KiKi'). Sålunda påverkar inhibitorer av blandad typ substratbindning (ökning eller minskning Km) och hämmar katalys i ES-komplexet (minskning Vmax).

När ett enzym har flera substrat kan hämmare uppvisa olika typer av hämning beroende på vilket substrat som övervägs. Detta resulterar från att det aktiva stället innehåller två olika bindningsställen inom det aktiva stället, ett för varje substrat. Till exempel kan en inhibitor konkurrera med substrat A om det första bindningsstället, men vara en icke-kompetitiv inhibitor med avseende på substrat B i det andra bindningsstället. [7]

Mätning av dissociationskonstanter för en reversibel hämmare Edit

Som noterats ovan kännetecknas en enzyminhibitor av sina två dissociationskonstanter, Ki och Ki', till enzymet respektive till enzym-substratkomplexet. Enzym-inhibitor konstant Ki kan mätas direkt med olika metoder en extremt noggrann metod är isotermisk titreringskalorimetri, där inhibitorn titreras till en lösning av enzym och den värme som frigörs eller absorberas mäts. [8] Men den andra dissociationskonstanten Ki' är svårt att mäta direkt, eftersom enzym-substratkomplexet är kortlivat och genomgår en kemisk reaktion för att bilda produkten. Därav, Ki' mäts vanligtvis indirekt genom att observera enzymaktiviteten under olika substrat- och inhibitorkoncentrationer och anpassa data [9] till en modifierad Michaelis-Menten-ekvation

där de modifierande faktorerna α och α' definieras av inhibitorkoncentrationen och dess två dissociationskonstanter

Således, i närvaro av inhibitorn, är enzymet effektivt Km och Vmax bli (α/α')Km och (1/α')Vmax, respektive. Den modifierade Michaelis-Menten-ekvationen antar dock att bindningen av inhibitorn till enzymet har nått jämvikt, vilket kan vara en mycket långsam process för inhibitorer med sub-nanomolära dissociationskonstanter. I dessa fall är det vanligtvis mer praktiskt att behandla den hårt bindande inhibitorn som en irreversibel inhibitor (se nedan), men det kan fortfarande vara möjligt att uppskatta Ki' kinetiskt om Ki mäts oberoende.

Effekterna av olika typer av reversibla enzymhämmare på enzymatisk aktivitet kan visualiseras med hjälp av grafiska representationer av Michaelis-Menten-ekvationen, såsom Lineweaver-Burk-plott, Eadie-Hofstee-plot eller Hanes-Woolf-plot. Till exempel, i Lineweaver–Burk-plotterna till höger, skär de kompetitiva hämningslinjerna på y-axel, vilket illustrerar att sådana inhibitorer inte påverkar Vmax. På samma sätt korsar de icke-konkurrerande hämningslinjerna på x-axel, visar dessa hämmare påverkar inte Km. Det kan dock vara svårt att uppskatta Ki och Ki' exakt från sådana plotter, [10] så det är tillrådligt att uppskatta dessa konstanter med mer tillförlitliga icke-linjära regressionsmetoder, som beskrivits ovan.

Reversibla inhibitorer Redigera

Traditionellt reversibla enzymhämmare har klassificerats som konkurrenskraftiga, icke-konkurrenskraftiga eller icke-konkurrenskraftiga, beroende på deras effekter på Km och Vmax. Dessa olika effekter beror på att inhibitorn binder till enzymet E, till enzym-substratkomplexet ES eller till båda. Uppdelningen av dessa klasser uppstår från ett problem i deras härledning och resulterar i behovet av att använda två olika bindningskonstanter för en bindningshändelse. Bindningen av en inhibitor och dess effekt på den enzymatiska aktiviteten är två distinkt olika saker, ett annat problem som de traditionella ekvationerna misslyckas med att erkänna. Vid icke-kompetitiv hämning resulterar bindningen av hämmaren i 100 % hämning av endast enzymet, och tar inte hänsyn till möjligheten till något däremellan. [11] Den vanliga formen av den hämmande termen döljer också förhållandet mellan hämmarens bindning till enzymet och dess förhållande till någon annan bindningsterm, vare sig det är Michaelis-Menten-ekvationen eller en dosresponskurva associerad med ligandreceptorbindning. För att visa sambandet kan följande omarrangemang göras:

Denna omarrangering visar att i likhet med Michaelis-Menten-ekvationen beror den maximala reaktionshastigheten på andelen av enzympopulationen som interagerar med dess substrat.

del av enzympopulationen bunden av substrat

del av enzympopulationen bunden av inhibitor

effekten av inhibitorn är ett resultat av procentandelen av enzympopulationen som interagerar med inhibitorn. Det enda problemet med denna ekvation i dess nuvarande form är att den antar absolut hämning av enzymet med inhibitorbindning, när det i själva verket kan finnas ett brett spektrum av effekter allt från 100 % hämning av substratomvandlingen till bara >0 %. För att ta hänsyn till detta kan ekvationen enkelt modifieras för att möjliggöra olika grader av hämning genom att inkludera ett delta Vmax termin.

Denna term kan sedan definiera den kvarvarande enzymatiska aktiviteten närvarande när inhibitorn interagerar med individuella enzymer i populationen. Men införandet av denna term har mervärdet att möjliggöra möjligheten till aktivering om den sekundära Vmax sikt visar sig vara högre än den initiala terminen. För att även ta hänsyn till eventuell aktivering kan notationen sedan skrivas om och ersätta inhibitorn "I" med en modifieringsterm som här betecknas som "X".

Även om denna terminologi resulterar i ett förenklat sätt att hantera kinetiska effekter relaterade till den maximala hastigheten för Michaelis–Menten-ekvationen, belyser den potentiella problem med termen som används för att beskriva effekter relaterade till Km. De Km relaterade till enzymets affinitet för substratet bör i de flesta fall relatera till potentiella förändringar i enzymets bindningsställe som skulle vara direkt ett resultat av enzyminhibitorinteraktioner. Som sådan term som liknar den som föreslagits ovan för att modulera Vmax bör vara lämpligt i de flesta situationer: [12]

Specialfall Redigera

  • Mekanismen för delvis kompetitiv hämning liknar den för icke-konkurrerande, förutom att EIS-komplexet har katalytisk aktivitet, som kan vara lägre eller till och med högre (partiellt kompetitiv aktivering) än enzym-substrat-komplexet (ES). Denna hämning visar vanligtvis en lägre Vmax, men en opåverkad Km värde. [13]
  • Okonkurrenskraftig hämning uppstår när inhibitorn endast binder till enzym-substratkomplexet, inte till det fria enzymet EIS-komplexet är katalytiskt inaktivt. Detta hämningssätt är sällsynt och orsakar en minskning av båda Vmax och den Km värde. [13]
  • Substrat- och produkthämning är där antingen substratet eller produkten av en enzymreaktion hämmar enzymets aktivitet. Denna hämning kan följa de konkurrenskraftiga, okonkurrenskraftiga eller blandade mönstren. Vid substrathämning sker en progressiv minskning av aktiviteten vid höga substratkoncentrationer. Detta kan indikera att det finns två substratbindande ställen i enzymet. [1] Vid lågt substrat är platsen med hög affinitet upptagen och normal kinetik följs. Men vid högre koncentrationer blir det andra hämmande stället upptaget, vilket hämmar enzymet. [14] Produkthämning är ofta ett reglerande inslag i ämnesomsättningen och kan vara en form av negativ feedback.
  • Långsamt tät hämning inträffar när det initiala enzym-inhibitorkomplexet EI genomgår isomerisering till ett andra mer tätt hållet komplex, EI*, men den övergripande inhiberingsprocessen är reversibel. Detta visar sig som långsamt ökande enzymhämning. Under dessa förhållanden ger traditionell Michaelis–Menten-kinetik ett falskt värde för Ki, som är tidsberoende. [1] Det verkliga värdet av Ki kan erhållas genom mer komplex analys av på (k) och av (kav) hastighetskonstanter för inhibitorassociation. Se irreversibel hämning nedan för mer information.
  • Bi-substrat analog hämmare är högaffinitets- och selektivitetshämmare som kan framställas för enzymer som katalyserar bimolekylära reaktioner genom att fånga bindningsenergin för varje substrat i en molekyl. [15][16] Till exempel, i formylöverföringsreaktionerna av purinbiosyntes, framställdes en potent multisubstrataddukthämmare (MAI) till GAR TFas syntetiskt genom att länka analoger av glycinamidribonukleotidsubstratet (GAR) och N-10 -formyltetrahydrofolat-kofaktor tillsammans för att producera tioglycinamidribonukleotiddideazafolat (TGDDF), [17] eller enzymatiskt från det naturliga GAR-substratet för att ge GDDF. [18] Här var den subnanomolära dissociationskonstanten (KD) för TGDDF större än förutspått, förmodligen på grund av entropiska fördelar och/eller positiva interaktioner som förvärvats genom atomerna som länkar samman komponenterna. MAI har också observerats produceras i celler genom reaktioner av prodrugs såsom isoniazid [19] eller enzyminhibitorligander (t.ex. PTC124) [20] med cellulära kofaktorer som NADH respektive ATP.

Exempel på reversibla inhibitorer Redigera

Eftersom enzymer har utvecklats för att binda sina substrat tätt, och de flesta reversibla inhibitorer binder på enzymernas aktiva ställe, är det föga förvånande att vissa av dessa inhibitorer är slående lika i strukturen till substraten för deras mål. Inhibitorer av DHFR är framträdande exempel. Andra exempel på dessa substrathärmar är proteashämmarna, en mycket framgångsrik klass av antiretrovirala läkemedel som används för att behandla HIV. [21] Strukturen för ritonavir, en proteashämmare baserad på en peptid och som innehåller tre peptidbindningar, visas till höger. Eftersom detta läkemedel liknar proteinet som är substratet för HIV-proteaset, konkurrerar det med detta substrat i enzymets aktiva plats.

Enzyminhibitorer är ofta utformade för att efterlikna övergångstillståndet eller intermediären av en enzymkatalyserad reaktion. Detta säkerställer att inhibitorn utnyttjar enzymets övergångstillståndsstabiliserande effekt, vilket resulterar i en bättre bindningsaffinitet (lägre Ki) än substratbaserade konstruktioner. Ett exempel på en sådan övergångstillståndshämmare är det antivirala läkemedlet oseltamivir, detta läkemedel härmar den plana naturen hos ringoxoniumjonen i reaktionen av det virala enzymet neuraminidas. [22]

Alla inhibitorer är dock inte baserade på strukturerna hos substrat. Till vänster visas till exempel strukturen för en annan HIV-proteashämmare tipranavir. Denna molekyl är inte baserad på en peptid och har ingen uppenbar strukturell likhet med ett proteinsubstrat. Dessa icke-peptidinhibitorer kan vara mer stabila än inhibitorer som innehåller peptidbindningar, eftersom de inte kommer att vara substrat för peptidaser och är mindre benägna att brytas ned. [23]

Vid läkemedelsdesign är det viktigt att beakta koncentrationerna av substrat som målenzymerna utsätts för. Till exempel har vissa proteinkinashämmare kemiska strukturer som liknar adenosintrifosfat, ett av substraten för dessa enzymer. Läkemedel som är enkla kompetitiva hämmare måste dock konkurrera med de höga koncentrationerna av ATP i cellen. Proteinkinaser kan också hämmas genom konkurrens vid bindningsställena där kinaserna interagerar med deras substratproteiner, och de flesta proteiner finns inuti celler i koncentrationer som är mycket lägre än koncentrationen av ATP. Som en konsekvens, om två proteinkinashämmare båda binder på det aktiva stället med liknande affinitet, men bara en måste konkurrera med ATP, kommer den kompetitiva inhibitorn vid det proteinbindande stället att hämma enzymet mer effektivt. [24]

Typer av irreversibel hämning (kovalent inaktivering) Redigera

Irreversibla inhibitorer modifierar vanligtvis ett enzym kovalent, och hämningen kan därför inte vändas. Irreversibla inhibitorer innehåller ofta reaktiva funktionella grupper såsom kvävesenap, aldehyder, haloalkaner, alkener, Michael-acceptorer, fenylsulfonater eller fluorfosfonater. Dessa nukleofila grupper reagerar med aminosyrasidokedjor för att bilda kovalenta addukter. De modifierade resterna är de med sidokedjor som innehåller nukleofiler såsom hydroxyl- eller sulfhydrylgrupper, dessa inkluderar aminosyrorna serin (som i DFP, höger), cystein, treonin eller tyrosin. [25]

Irreversibel hämning skiljer sig från irreversibel enzyminaktivering. Irreversibla inhibitorer är i allmänhet specifika för en klass av enzymer och inaktiverar inte alla proteiner, de fungerar inte genom att förstöra proteinstrukturen utan genom att specifikt ändra det aktiva stället för deras mål. Till exempel orsakar extrema pH eller temperaturer vanligtvis denaturering av all proteinstruktur, men detta är en ospecifik effekt. På liknande sätt förstör vissa ospecifika kemiska behandlingar proteinstrukturen: till exempel kommer uppvärmning i koncentrerad saltsyra att hydrolysera peptidbindningarna som håller ihop proteinerna och frigör fria aminosyror. [26]

Irreversible inhibitors display time-dependent inhibition and their potency therefore cannot be characterised by an IC50 värde. [1] [27] This is because the amount of active enzyme at a given concentration of irreversible inhibitor will be different depending on how long the inhibitor is pre-incubated with the enzyme. Istället, kobs/[jag] values are used, [28] where kobs is the observed pseudo-first order rate of inactivation (obtained by plotting the log of % activity vs. time) and [jag] is the concentration of inhibitor. De kobs/[jag] parameter is valid as long as the inhibitor does not saturate binding with the enzyme (in which case kobs = kinact).

Analysis of irreversible inhibition Edit

As shown in the figure to the right, irreversible inhibitors have a short instance where they form a reversible non-covalent complex with the enzyme (EI or ESI) and this then reacts to produce the covalently modified "dead-end complex" EI* (an irreversible covalent complex). The rate at which EI* is formed is called the inactivation rate or kinact. Since formation of EI may compete with ES, binding of irreversible inhibitors can be prevented by competition either with substrate or with a second, reversible inhibitor. This protection effect is good evidence of a specific reaction of the irreversible inhibitor with the active site.

The binding and inactivation steps of this reaction are investigated by incubating the enzyme with inhibitor and assaying the amount of activity remaining over time. The activity will be decreased in a time-dependent manner, usually following exponential decay. Fitting these data to a rate equation gives the rate of inactivation at this concentration of inhibitor. This is done at several different concentrations of inhibitor. If a reversible EI complex is involved the inactivation rate will be saturable and fitting this curve will give kinact och Ki. [29]

Another method that is widely used in these analyses is mass spectrometry. Here, accurate measurement of the mass of the unmodified native enzyme and the inactivated enzyme gives the increase in mass caused by reaction with the inhibitor and shows the stoichiometry of the reaction. [30] This is usually done using a MALDI-TOF mass spectrometer. In a complementary technique, peptide mass fingerprinting involves digestion of the native and modified protein with a protease such as trypsin. This will produce a set of peptides that can be analysed using a mass spectrometer. The peptide that changes in mass after reaction with the inhibitor will be the one that contains the site of modification.

Special cases Edit

Not all irreversible inhibitors form covalent adducts with their enzyme targets. Some reversible inhibitors bind so tightly to their target enzyme that they are essentially irreversible. These tight-binding inhibitors may show kinetics similar to covalent irreversible inhibitors. In these cases, some of these inhibitors rapidly bind to the enzyme in a low-affinity EI complex and this then undergoes a slower rearrangement to a very tightly bound EI* complex (see figure above). This kinetic behaviour is called slow-binding. [32] This slow rearrangement after binding often involves a conformational change as the enzyme "clamps down" around the inhibitor molecule. Examples of slow-binding inhibitors include some important drugs, such methotrexate, [33] allopurinol, [34] and the activated form of acyclovir. [35]

Examples of irreversible inhibitors Edit

Diisopropylfluorophosphate (DFP) is shown as an example of an irreversible protease inhibitor in the figure above right. The enzyme hydrolyses the phosphorus–fluorine bond, but the phosphate residue remains bound to the serine in the active site, deactivating it. [36] Similarly, DFP also reacts with the active site of acetylcholine esterase in the synapses of neurons, and consequently is a potent neurotoxin, with a lethal dose of less than 100 mg. [37]

Suicide inhibition is an unusual type of irreversible inhibition where the enzyme converts the inhibitor into a reactive form in its active site. An example is the inhibitor of polyamine biosynthesis, α-difluoromethylornithine or DFMO, which is an analogue of the amino acid ornithine, and is used to treat African trypanosomiasis (sleeping sickness). Ornithine decarboxylase can catalyse the decarboxylation of DFMO instead of ornithine, as shown above. However, this decarboxylation reaction is followed by the elimination of a fluorine atom, which converts this catalytic intermediate into a conjugated imine, a highly electrophilic species. This reactive form of DFMO then reacts with either a cysteine or lysine residue in the active site to irreversibly inactivate the enzyme. [31]

Since irreversible inhibition often involves the initial formation of a non-covalent EI complex, it is sometimes possible for an inhibitor to bind to an enzyme in more than one way. For example, in the figure showing trypanothione reductase from the human protozoan parasite Trypanosoma cruzi, two molecules of an inhibitor called quinacrine mustard are bound in its active site. The top molecule is bound reversibly, but the lower one is bound covalently as it has reacted with an amino acid residue through its nitrogen mustard group. [38]

New drugs are the products of a long drug development process, the first step of which is often the discovery of a new enzyme inhibitor. In the past the only way to discover these new inhibitors was by trial and error: screening huge libraries of compounds against a target enzyme and hoping that some useful leads would emerge. This brute force approach is still successful and has even been extended by combinatorial chemistry approaches that quickly produce large numbers of novel compounds and high-throughput screening technology to rapidly screen these huge chemical libraries for useful inhibitors. [39]

More recently, an alternative approach has been applied: rational drug design uses the three-dimensional structure of an enzyme's active site to predict which molecules might be inhibitors. [40] These predictions are then tested and one of these tested compounds may be a novel inhibitor. This new inhibitor is then used to try to obtain a structure of the enzyme in an inhibitor/enzyme complex to show how the molecule is binding to the active site, allowing changes to be made to the inhibitor to try to optimise binding. This test and improve cycle is then repeated until a sufficiently potent inhibitor is produced. [41] Computer-based methods of predicting the affinity of an inhibitor for an enzyme are also being developed, such as molecular docking [42] and molecular mechanics.

Enzyme inhibitors are found in nature and are also designed and produced as part of pharmacology and biochemistry. Natural poisons are often enzyme inhibitors that have evolved to defend a plant or animal against predators. These natural toxins include some of the most poisonous compounds known. Artificial inhibitors are often used as drugs, but can also be insecticides such as malathion, herbicides such as glyphosate, or disinfectants such as triclosan. Other artificial enzyme inhibitors block acetylcholinesterase, an enzyme which breaks down acetylcholine, and are used as nerve agents in chemical warfare.

Chemotherapy Edit

The most common uses for enzyme inhibitors are as drugs to treat disease. Many of these inhibitors target a human enzyme and aim to correct a pathological condition. However, not all drugs are enzyme inhibitors. Some, such as anti-epileptic drugs, alter enzyme activity by causing more or less of the enzyme to be produced. These effects are called enzyme induction and inhibition and are alterations in gene expression, which is unrelated to the type of enzyme inhibition discussed here. Other drugs interact with cellular targets that are not enzymes, such as ion channels or membrane receptors.

An example of a medicinal enzyme inhibitor is sildenafil (Viagra), a common treatment for male erectile dysfunction. This compound is a potent inhibitor of cGMP specific phosphodiesterase type 5, the enzyme that degrades the signalling molecule cyclic guanosine monophosphate. [43] This signalling molecule triggers smooth muscle relaxation and allows blood flow into the corpus cavernosum, which causes an erection. Since the drug decreases the activity of the enzyme that halts the signal, it makes this signal last for a longer period of time.

Another example of the structural similarity of some inhibitors to the substrates of the enzymes they target is seen in the figure comparing the drug methotrexate to folic acid. Folic acid is a substrate of dihydrofolate reductase, an enzyme involved in making nucleotides that is potently inhibited by methotrexate. Methotrexate blocks the action of dihydrofolate reductase and thereby halts the production of nucleotides. This block of nucleotide biosynthesis is more toxic to rapidly growing cells than non-dividing cells, since a rapidly growing cell has to carry out DNA replication, therefore methotrexate is often used in cancer chemotherapy. [44]

Antibiotics Edit

Drugs also are used to inhibit enzymes needed for the survival of pathogens. For example, bacteria are surrounded by a thick cell wall made of a net-like polymer called peptidoglycan. Many antibiotics such as penicillin and vancomycin inhibit the enzymes that produce and then cross-link the strands of this polymer together. [45] This causes the cell wall to lose strength and the bacteria to burst. In the figure, a molecule of penicillin (shown in a ball-and-stick form) is shown bound to its target, the transpeptidase from the bacteria Streptomyces R61 (the protein is shown as a ribbon-diagram).

Antibiotic drug design is facilitated when an enzyme that is essential to the pathogen's survival is absent or very different in humans. In the example above, humans do not make peptidoglycan, therefore inhibitors of this process are selectively toxic to bacteria. Selective toxicity is also produced in antibiotics by exploiting differences in the structure of the ribosomes in bacteria, or how they make fatty acids.

Metabolic control Edit

Enzyme inhibitors are also important in metabolic control. Many metabolic pathways in the cell are inhibited by metabolites that control enzyme activity through allosteric regulation or substrate inhibition. A good example is the allosteric regulation of the glycolytic pathway. This catabolic pathway consumes glucose and produces ATP, NADH and pyruvate. A key step for the regulation of glycolysis is an early reaction in the pathway catalysed by phosphofructokinase-1 (PFK1). When ATP levels rise, ATP binds an allosteric site in PFK1 to decrease the rate of the enzyme reaction glycolysis is inhibited and ATP production falls. This negative feedback control helps maintain a steady concentration of ATP in the cell. However, metabolic pathways are not just regulated through inhibition since enzyme activation is equally important. With respect to PFK1, fructose 2,6-bisphosphate and ADP are examples of metabolites that are allosteric activators. [46]

Physiological enzyme inhibition can also be produced by specific protein inhibitors. This mechanism occurs in the pancreas, which synthesises many digestive precursor enzymes known as zymogens. Many of these are activated by the trypsin protease, so it is important to inhibit the activity of trypsin in the pancreas to prevent the organ from digesting itself. One way in which the activity of trypsin is controlled is the production of a specific and potent trypsin inhibitor protein in the pancreas. This inhibitor binds tightly to trypsin, preventing the trypsin activity that would otherwise be detrimental to the organ. [47] Although the trypsin inhibitor is a protein, it avoids being hydrolysed as a substrate by the protease by excluding water from trypsin's active site and destabilising the transition state. [48] Other examples of physiological enzyme inhibitor proteins include the barstar inhibitor of the bacterial ribonuclease barnase. [49]

Bekämpningsmedel Redigera

Many pesticides are enzyme inhibitors. Acetylcholinesterase (AChE) is an enzyme found in animals, from insects to humans. It is essential to nerve cell function through its mechanism of breaking down the neurotransmitter acetylcholine into its constituents, acetate and choline. This is somewhat unusual among neurotransmitters as most, including serotonin, dopamine, and norepinephrine, are absorbed from the synaptic cleft rather than cleaved. A large number of AChE inhibitors are used in both medicine and agriculture. Reversible competitive inhibitors, such as edrophonium, physostigmine, and neostigmine, are used in the treatment of myasthenia gravis and in anaesthesia. The carbamate pesticides are also examples of reversible AChE inhibitors. The organophosphate pesticides such as malathion, parathion, and chlorpyrifos irreversibly inhibit acetylcholinesterase.

The herbicide glyphosate is an inhibitor of 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase, [50] other herbicides, such as the sulfonylureas inhibit the enzyme acetolactate synthase. Both these enzymes are needed for plants to make branched-chain amino acids. Many other enzymes are inhibited by herbicides, including enzymes needed for the biosynthesis of lipids and carotenoids and the processes of photosynthesis and oxidative phosphorylation. [51]

Natural poisons Edit

Animals and plants have evolved to synthesise a vast array of poisonous products including secondary metabolites, peptides and proteins that can act as inhibitors. Natural toxins are usually small organic molecules and are so diverse that there are probably natural inhibitors for most metabolic processes. [52] The metabolic processes targeted by natural poisons encompass more than enzymes in metabolic pathways and can also include the inhibition of receptor, channel and structural protein functions in a cell. For example, paclitaxel (taxol), an organic molecule found in the Pacific yew tree, binds tightly to tubulin dimers and inhibits their assembly into microtubules in the cytoskeleton. [53]

Many natural poisons act as neurotoxins that can cause paralysis leading to death and have functions for defence against predators or in hunting and capturing prey. Some of these natural inhibitors, despite their toxic attributes, are valuable for therapeutic uses at lower doses. [54] An example of a neurotoxin are the glycoalkaloids, from the plant species in the family Solanaceae (includes potato, tomato and eggplant), that are acetylcholinesterase inhibitors. Inhibition of this enzyme causes an uncontrolled increase in the acetylcholine neurotransmitter, muscular paralysis and then death. Neurotoxicity can also result from the inhibition of receptors for example, atropine from deadly nightshade (Atropa belladonna) that functions as a competitive antagonist of the muscarinic acetylcholine receptors. [55]

Although many natural toxins are secondary metabolites, these poisons also include peptides and proteins. An example of a toxic peptide is alpha-amanitin, which is found in relatives of the death cap mushroom. This is a potent enzyme inhibitor, in this case preventing the RNA polymerase II enzyme from transcribing DNA. [56] The algal toxin microcystin is also a peptide and is an inhibitor of protein phosphatases. [57] This toxin can contaminate water supplies after algal blooms and is a known carcinogen that can also cause acute liver hemorrhage and death at higher doses. [58]

Proteins can also be natural poisons or antinutrients, such as the trypsin inhibitors (discussed above) that are found in some legumes, as shown in the figure above. A less common class of toxins are toxic enzymes: these act as irreversible inhibitors of their target enzymes and work by chemically modifying their substrate enzymes. An example is ricin, an extremely potent protein toxin found in castor oil beans. This enzyme is a glycosidase that inactivates ribosomes. Since ricin is a catalytic irreversible inhibitor, this allows just a single molecule of ricin to kill a cell. [59]


Mechanism of Transformation (With Diagram) | Genetik

Notani and Setlow (1974) have described the mechanism of bacterial transformation. Moreover, in S. pneumoniae the competent state is transient and persists only for a short period. The competent state is induced by the competence activator protein of molecular weight of 1,000 Dalton.

It binds to the plasma membrane of receptor and triggers the synthesis of 10 new proteins within 10 minutes. The competence factor (CF) accelerates the process of transport or leakage of autolysin molecules into the periplasmic space. Moreover, in H. influenzae no competence factors have been reported.

Only Changes in cell envelope accompany the development of competence state. The cell envelope of competent cells contains increased level of polysacccharide as compared to the cells of log phase.

Structural changes in competent cells induce numerous vesicles called transformosome buds on the surface that contains protein and mediates the uptake of transforming DNA. Transformation is accomplished in the following steps (Fig.8.4).

Fig. 8.4 : Diagrammatic presentation of transformation in streptococci.

As a result of random collision, DNA comes first in the contact of cell surface of competent bacteria (Figs. 8.4 and 8.5 A-B). First the DNA binding is reversible and lasts for about 4-5 seconds. Thereafter, it becomes irreversible permanently. For about 2 minutes it remains in non-transforming state. Thereafter, before 5 minutes it is converted into the transforming state.

The period (about 10 minutes) during which no transformation occurs in competent recipient cells is called eclipse. Both types of DNA, transforming and non-transforming, bind to the cell surface where the receptor sites are located. In B. subtilis membrane vesicles in competent cells are found that bind to 20 mg of dsDNA/mg of membrane protein. The competent cells show six fold more DNA binding sites than the non-competent cells.

In H influenzae transformosome bud forms the surface and contains proteins that mediate DNA uptake. It binds with conserved sequence (5’AAGTGCGGTCA 3′) present at 4 kb interval on DNA. The DNA uptake site contains two proteins of 28 and 52 kilo-Daltons. After binding, the receptor proteins present the donor DNA to the membrane associated uptake sites.

In S. pneumoniae the CF induces the ability to bind DNA molecules.

The DNA molecules that bind permanently enter the competent recipient cells. DNA is also resistant to DNase degradation. The nucleolytic enzymes located at the surface of competent recipient cells act upon the donor DNA molecule when it binds the cell membrane.

The endonuclease-1 of the recipient cells which is associated with cell membrane acts as DNA translocase by attacking and degrading one strand of the dsDNA. Consequently only complementary single strand of DNA enters into the recipient cells (Figs. 8.4 and 8.5A).

It has been confirmed by performing the experiments with radiolabelling of donor DNA. The mutant cells of S. pneumoniae lack endonuclease – 1, therefore, transformation does not occur. Interestingly in B. subtilis degradation of one strand is being delayed. Hence, both the strands enter the recipient cell. The upper limit of peneterating DNA into the recipient cell is about 750 base pairs.

The size of donor DNA affects transformation. Successful transformation occurs with the donor DN.A of molecular weight between 30,00,000 and 8 million Dalton. With increasing the concentration of donor DNA the number of competent cells increases. DNA uptake process is the energy requiring mechanism because it can be inhibited by the energy requiring inhibitors.

After penetration the donor DNA migrates from periphery of cell to the bacterial DNA. This movement in different bacteria differs. For example, in B. subtilis this movement occurs for about 16-60 minutes. During this movement, DNA is associated with mesosomes which possibly transport it to the bacterial DNA.

(c) Synapsis formation:

The single stranded DNA is coated with SSB proteins, which maintain, the single stranded region in a replication fork (Fig. 8.5B). The single strand of the donor DNA or portion of it is linearly inserted into the recipient DNA (Fig. 8.5 C-D). The bacterial protein like E. coli RecA protein probably facilitates the DNA pairing during recombination. It causes the local unwinding of dsDNA of the recipient cell from the 5′ end.

How the displaced single strand is cut, still not known? Base pairing i.e. synapsis occurs between the homologous donor ssDNA and the recipient DNA. Unwinding of the recipient DNA continues at the end of assimilated DNA and allows the fraction of invading DNA to increase base pairs. This process is called branch migration (F).

The endonuclease cuts the unpaired free end of donor DNA or the recipient DNA. This process is called trimming (Fig. 8.5E-F). The nick is sealed by DNA ligase (G). Consequently, a heteroduplex region containing a mismatched base pairs is formed (H). Furthermore, in the progenies whether the donor marker is or is not recovered, depends on the occurrence of mismatch repair.

If the mismatch repair occurs again, it depends whether the unpaired base in the donor or recipient strand is removed. After replication the heteroduplex forms the homo-duplexes, one of these is of normal type and the second is transformed duplex. The normal duplex is from the recipient cell in origin, whereas the transformed duplex is from the donor genome.

The efficiency of integration of genetic markers into the genome of recipient cell varies with different genes that the recipient cell possesses. This genetic trait is called hex (high efficiency of integration). The hex system eliminates a large fraction of low efficiency (LE) markers and permits high efficiency (HE) markers to be integrated. Therefore, the hex function is a mismatch-base correction system.

The donor genes differing from the recipient genes by a single base pair create a mismatch when integrated initially. The hex mismatch repair system (with LE markers) can correct either of donor strands. Therefore, there is fifty-fifty chance for a given marker to be retained. The HE markers correct only the recipient strand.

For the LE markers, hex mismatch repair system unusually removes the mismatched bases of the donor DNA and the cell retains the recipient genotype, whereas for HE markers the same system removes the mismatched bases of recipient DNA and the cell consists of donor genotype.

In the later case, after replication of chromosome and cell division the one progeny cell contains the donor genotype and the other has the recipient genotype. These two types of cells can be differentiated through plating method by using the antibiotic markers.

However, for pneumococci it is a general feature that all the strains discriminate between LH and HE markers when transformation has occurred with homologous DNA. The hex – cells (mutant in hex function) fail to discriminate between the two markers and, therefore, integrate all markers with high efficiency, because one of the two daughter cells after cell division contains the genotype.


Summary – Reversible vs Irreversible Inhibition

Enzyme inhibition can be either reversible or irreversible. In summarizing the difference between reversible and irreversible inhibition in reversible inhibition, the inhibitor binds with the enzyme non-covalently. Hence, the unbinding of the inhibitor from the enzyme is easy and rapid. On the other hand, in irreversible inhibition, the inhibitor binds with the enzyme covalently. Therefore, the inhibitor strongly binds with the enzyme and the dissociation of the enzyme-inhibitor complex is slow and hard. Therefore, this is the key difference between reversible and irreversible inhibition. Furthermore, in reversible inhibition, the reaction can be reversed, and the enzyme can be reactivated again. But in irreversible inhibition, the reaction cannot be reversed, and the enzyme cannot be activated again.

Referens:

1. “Enzyme Inhibitor.” Wikipedia, Wikimedia Foundation, 1 Jan. 2019. Available here
2. “Enzyme Inhibitor.” NeuroImage, Academic Press. Tillgänglig här

Bild med tillstånd:

1.”DHFR methotrexate inhibitor”By Thomas Shafee – Own work, (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2.”Covalent-drugs-silence-proteins”By Dr. Juswinder Singh (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia


5A: Introduction to Reversible Binding - Biology

There are two types of reversible inhibitors:

In both cases reversible inhibitors can be removed from the enzymes - but only under certain conditions.

Konkurrensmässig hämning

Competitive inhibitors are inhibitors that compete with substrates for the active site. They resemble the substrate in that they can fit into the active site,fooling the enzyme into thinking that they are substrates. They differ from the substrate in that they are unreactive. They therefore reduce the number of enzymes available to catalyse a reaction. If there is enough substrate available though, the chances of an enzyme attracting an inhibitor is smaller - most enzymes will still attract the correct substrates and a reaction can still occur. To help overcome the effect of a competitive inhibitor, the substrate concentration should be increased. The inhibitors usually leave the active site when the substrate concentration is high enough.


Inhibitors are not always poisons or harmful. An example of an inhibitor used in treating poisons is in poisoning. Ethylene glycol is a component of car antifreezes. By itself it is a harmless substance but it is broken down in the body into oxalic acid (a deadly poison) by the enzyme, alcohol dehydrogenase. Alcohol (ethanol) acts as a competitive inhibitor for alcohol dehydrogenase. Giving the patient large amounts of alcohol will cause the ethanol to compete with ethylene glycol for the active site of alcohol dehydrogenase. Alcohol is the preferred substrate for alcohol dehydrogenase so when it is present, it binds with the enzyme. After a while, the ethylene glycol is harmlessly excreted.

Various poisons such as cyanide, arsenic and mercury - in fact many heavy metal ions - act as inhibitors. HCN binds to the active site of various cytochromases which are enzymes that are responsible for catalysing oxidation and reduction processes in cellular respiration. Many diet pills of the 1920s contained arsenic! These inhibited certain digestive enzymes in the human alimentary canal.

Non-competitive inhibition

These substances do not bind to the active site of an enzyme, but rather to other parts of the enzyme. In doing so, they may change the conformation of the active site as has already been explained (breaking certain hydrogen bonds and forming incorrect ones, changing the shape of the active site) and possibly inactivate it.

A non-competitive inhibitor will eventually leave the binding site. Substrate molecules have nothing to do with this, as these inhibitors do not bind to the active site, and therefore have a greater inhibitory effect. A greater substrate concentration will not help as substrate molecules only compete for positions at the active site. Examples include lead, mercury and chromium.


Many pesticides and herbicides are also inhibitors. Read the pamphlet inside the boxes of garden or household poisons and see how these function. Look at medicine pamphlets as well. You will often find that many use inhibitors that block active sites of bacterial enzymes, killing them or stopping their reproduction. Some painkillers also act as inhibitors, eg aspirin.

Förklaring

When a competitive inhibitor is present, the enzyme activity is decreased compared to when no inhibitor is present. As the substrate concentration is increased, the activity eventually becomes the same.

You will notice that the optimum substrate concentration is much higher.

With a non-competitive inhibitor, the inhibition is not dependent on the substrate concentration and the effect is similar to an irreversible inhibitor.


Reversible Reactions

In reversible reactions, the reactants and products are never fully consumed they are each constantly reacting and being produced. A reversible reaction can take the following summarized form:

This reversible reaction can be broken into two reactions.

Reaction 1: [ A + B xrightarrowC+D ]

Reaction 2: [ C + D xrightarrow>A+B ]

These two reactions are occurring samtidigt , which means that the reactants are reacting to yield the products, as the products are reacting to produce the reactants . Collisions of the reacting molecules cause chemical reactions in a closed system. After products are formed, the bonds between these products are broken when the molecules collide with each other, producing sufficient energy needed to break the bonds of the product and reactant molecules.

Below is an example of the summarized form of a reversible reaction and a breakdown of the reversible reaction N2O4 &harr 2NO2

Reaction 1 and Reaction 2 happen at the same time because they are in a closed system.

Blue : Nitrogen Red : Oxygen

Imagine a ballroom. Let reactant A be 10 girls and reactant B be 10 boys. As each girl and boy goes to the dance floor, they pair up to become a product. Once five girls and five boys are on the dance floor, one of the five pairs breaks up and moves to the sidelines, becoming reactants again. As this pair leaves the dance floor, another boy and girl on the sidelines pair up to form a product once more. This process continues over and over again, representing a reversible reaction.

Unlike irreversible reactions, reversible reactions lead to equilibrium: in reversible reactions, the reaction proceeds in both directions whereas in irreversible reactions the reaction proceeds in only one direction. To learn more about this phenomenon, click here: Chemical Equilibrium

If the reactants are formed at the same rate as the products, a dynamic equilibrium exists. For example, if a water tank is being filled with water at the same rate as water is leaving the tank (through a hypothetical hole), the amount of water remaining in the tank remains consistent.


Reversible covalent direct thrombin inhibitors

Introduktion: In recent years, the traditional treatments for thrombotic diseases, heparin and warfarin, are increasingly being replaced by novel oral anticoagulants offering convenient dosing regimens, more predictable anticoagulant responses, and less frequent monitoring. However, these drugs can be contraindicated for some patients and, in particular, their bleeding liability remains high.

Metoder: We have developed a new class of direct thrombin inhibitors (VE-DTIs) and have utilized kinetics, biochemical, and X-ray structural studies to characterize the mechanism of action and in vitro pharmacology of an exemplary compound from this class, Compound 1.

Resultat: We demonstrate that Compound 1, an exemplary VE-DTI, acts through reversible covalent inhibition. Compound 1 inhibits thrombin by transiently acylating the active site S195 with high potency and significant selectivity over other trypsin-like serine proteases. The compound inhibits the binding of a peptide substrate with both clot-bound and free thrombin with nanomolar potency. Compound 1 is a low micromolar inhibitor of thrombin activity against endogenous substrates such as fibrinogen and a nanomolar inhibitor of the activation of protein C and thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. In the thrombin generation assay, Compound 1 inhibits thrombin generation with low micromolar potency but does not increase the lag time for thrombin formation. In addition, Compound 1 showed weak inhibition of clotting in PT and aPTT assays consistent with its distinctive profile in the thrombin generation assay.

Slutsats: Compound 1, while maintaining strong potency comparable to the current DTIs, has a distinct mechanism of action which produces a differentiating pharmacological profile. Acting through reversible covalent inhibition, these direct thrombin inhibitors could lead to new anticoagulants with better combined efficacy and bleeding profiles.

Uttalande av intressekonflikt

MS, MR, KL, TPS, DMC, LI, SC, PZ, MAE, KMS, DCW, AD, and DBK are employees of Verseon Corporation. EDC discloses a financial interest in Verseon Corporation and funding through NIH grants HL049413, HL073813, and HL112303. NP discloses a financial interest in Hemadvance, LLC and funding through AHA grant AHA15SDG25550094. KMS and DCW are inventors on a patent application (WO/2014/149139) that includes Compound 1 and has local applications pending in numerous jurisdictions worldwide. This does not alter our adherence to PLOS ONE policies on sharing data and materials.

Siffror

Fig 1. Structures of Compound 1, the…

Fig 1. Structures of Compound 1, the dansylated Compound 2, and the deacylated Compound 3…

Fig 2. Interaction of Compound 1 with…

Fig 2. Interaction of Compound 1 with thrombin.

Compound 1 at 1 μM was incubated…

Fig 4. Structural model of the thrombin…

Fig 4. Structural model of the thrombin active site.

The structural model of the thrombin…

Fig 5. Interaction diagram for the thrombin…

Fig 5. Interaction diagram for the thrombin active site modified by Compound 1.

Fig 6. Kinetic characterization of Compound 1.

Fig 6. Kinetic characterization of Compound 1.

Fig 7. Spontaneous recovery of thrombin activity.

Fig 7. Spontaneous recovery of thrombin activity.

% Thrombin activity was recorded as a function…

Fig 8. Thrombograms from the thrombin generation…

Fig 8. Thrombograms from the thrombin generation assay for argatroban, dabigatran, and Compound 1.


AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF MINIMAL AMOUNT OF ACETYLCHOLINESTERASE FROM NERVOUS TISSUES AND ERYTHROCYTE MEMBRANES

Publisher Summary

This chapter discusses the affinity chromatography of minimal amount of acetylcholinesterase from nervous tissues and erythrocyte membranes. It discusses a study in which a suitable method for the selective isolation of AChE from other proteins, by affinity chromatography, was worked out by integrating and modifying three available methods. Affigel 202 (Bio-Rad) was covalently linked to a specific and reversible AChE inhibitor. This inhibitor was synthesized, and its properties as the differential inhibitor of AChE and butyrilcholinesterase (3.1.1.8.) (BuChE) were examined. The values of PI 50 were found to be 3.8, 4.0, and 2.0 for rat brain AChE, electric eel AChE, and horse serum BuChE, respectively. According to the batchwise procedure, finally adopted, the sample containing at least 60 mU was loaded onto a similar volume of the affinity chromatography gel and the unbound proteins were removed by centrifugation. After three washings with a threefold volume of saline phosphate buffer, AChE was eluted in two steps from the gel by choline chloride solution, which proved effective because of the poor affinity of the linked inhibitor for AChE. The AChE activity, recovered after centrifugation and dialysis of the supernatant, was about 90% of the activity in the sample.

Vi använder cookies för att tillhandahålla och förbättra vår tjänst och skräddarsy innehåll och annonser. Genom att fortsätta godkänner du användning av cookies .


Titta på videon: Differentialkalkyl flerdim del 1 - partiell derivata, introduktion (Augusti 2022).