Information

2.2: Allmänna färgningsmetoder - Biologi

2.2: Allmänna färgningsmetoder - Biologi



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

LÄRANDEMÅL

  • Jämför och kontrast in vitro och in vivo färgning

Färgning är en teknik som används i mikroskopi för att förbättra kontrasten i en mikroskopisk bild. Fläckar och färgämnen används ofta för att framhäva strukturer i mikrober för visning, ofta med hjälp av olika mikroskop. Fläckar kan användas för att definiera och undersöka olika typer av mikrober, olika stadier av cellulärt liv (t.ex. den mitotiska cykeln) och till och med organeller i individuella celler (t.ex. mitokondrier eller kloroplaster).

In vivo färgning är processen att färga levande vävnad — in vivo betyder "i livet" (i motsats till in vitro färgning). När en viss cell eller struktur antar kontrasterande färg(er), kan dess form (morfologi) eller position inom en cell eller vävnad lätt ses och studeras. Det vanliga syftet är att avslöja cytologiska detaljer som annars kanske inte skulle vara uppenbara; Men färgning kan också avslöja var vissa kemikalier eller specifika kemiska reaktioner äger rum i cellerna. In vitro färgning involverar färgning av celler eller strukturer som har tagits bort från sitt biologiska sammanhang. Vissa fläckar kombineras ofta för att avslöja fler detaljer och egenskaper än en enda fläck kan avslöja ensam, och en motfärgning är en fläck som ökar synligheten av celler eller strukturer när den huvudsakliga fläcken inte är tillräcklig. Forskare och läkare kan kombinera färgning med specifika protokoll för fixering och provberedning och kan använda dessa standardtekniker som konsekventa, repeterbara diagnostiska verktyg.

Det finns otroligt många fläckar som kan användas i en mängd olika metoder. Det som följer här är några vanliga aspekter av processen att förbereda sig för in vitro färgning.

  • Fixering: Detta kan i sig bestå av flera steg. Fixering syftar till att bevara formen på cellerna (i detta fall mikrober) så mycket som möjligt. Ibland används värmefixering för att döda, fästa och förändra cellerna så att de accepterar fläckar. De flesta kemiska fixativ genererar kemiska bindningar mellan proteiner och andra ämnen i provet, vilket ökar deras styvhet. Vanliga fixativ inkluderar formaldehyd, etanol, metanol och pikrinsyra.
  • Permeabilisering: Detta innebär behandling av cellerna med (vanligtvis) ett milt ytaktivt ämne. Denna behandling löser upp cellmembran, vilket gör att större färgämnesmolekyler kan komma in i cellens inre.
  • Montering: Detta steg innebär vanligtvis att proverna fästs på ett objektglas för observation och analys. I vissa fall kan celler odlas direkt på ett objektglas. För prover av lösa celler kan provet appliceras direkt på ett objektglas.

Som enklast kan själva färgningsprocessen innebära nedsänkning av provet (före eller efter fixering och montering) i färglösning, följt av sköljning och observation. Många färgämnen kräver dock användning av ett betsmedel - en kemisk förening som reagerar med fläcken för att bilda en olöslig färgad fällning. När överskottet av färglösningen tvättas bort finns den bettade fläcken kvar. Det finns en otrolig mängd fläckar som kan användas i det här steget, från de som färgar specifika mikrobiella typer (se figuren nedan) till de som framhäver sub-avdelningar eller organeller i en cell, såsom kärnan eller endoplasmatiskt retikulum. Alternativt kan negativ färgning användas. Detta är en enkel färgningsmetod för bakterier, utförd genom att smeta ut cellerna på objektglaset och sedan applicera nigrosin (ett svart syntetiskt färgämne) eller indiskt bläck (en vattenhaltig suspension av kolpartiklar). Efter torkning kan mikroorganismerna ses i ljusfältsmikroskopi eftersom ljusare inneslutningar kontrasterar bra mot den mörka miljön som omger dem

Leva, in vivo färgningsmikroskopi delar många av dessa steg, med undantag för fixering, som alltid dödar mikroben som ska undersökas.

Nyckelord

  • In vivo-färgning, som visualiserar celler som är levande, och in vitro-färgning, som visualiserar fixerade celler, har båda viktiga användningsområden.
  • Det finns ett stort utbud av fläckar som kan användas på mikrober som kan framhäva nästan alla egenskaper hos en cell, även organeller i en cell.
  • Färgningsprotokoll kan vara komplexa, men de delar några grundläggande steg: förberedelse, fixering, färgning och montering.

Nyckelbegrepp

  • tensid: ett ytaktivt medel, eller vätmedel, med förmåga att reducera ytspänningen hos en vätska; typiskt organiska föreningar som har ett hydrofilt "huvud" och en hydrofob "svans"
  • organell: en specialiserad struktur som finns inuti celler som utför en specifik livsprocess (t.ex. ribosomer, vakuoler)

2.2: Allmänna färgningsmetoder - Biologi

Dessa helt nya resurser stödjer användningen av praktiker över olika biologispecifikationer på A-nivå (OCR, AQA och Edexcel).

  • Testat material för att stödja Common Practical Assessment Criteria nyckelpraktik
  • Stödmaterial för lärare, tekniker och studenter
  • Studentrevisionsmaterial för att hjälpa till att revidera för indirekt granskning av praktiker

Den här nya resursen stöder användningen av praktik över olika A-nivå biologi 2015 specifikationer för England (OCR, AQA, Edexcel och Eduqas).

Detta experiment tillåter eleverna att gå från växten på skrivbordet till att observera ett färgat prov under mikroskopet på mindre än 4 minuter (som visas i bilderna ovan). Det visade provet visar tydligt placeringen av kärlknippen och xylem, floem och sklerenkym eller kollenkym.

Användningen av färgen toluidinblått ger en färgskillnad mellan lignifierade och icke-lignifierade cellväggar, vilket tydligt framhäver specialiserade celler och en anpassning de har.

Detta experiment ger ett snabbt och iögonfallande sätt att lära ut om kärlvävnaden i växter och strukturen hos växtstammar. Det ger eleverna möjlighet att utveckla (och demonstrera) sina vetenskapliga ritfärdigheter såväl som deras användning av ett ljusmikroskop och okulargitter.

  • Testat material för att stödja A-nivå praktiskt stöd (CPAC)
  • Stödmaterial för lärare och tekniker
  • Elevarbetsblad för att ge bevis för att uppfylla de praktiska färdighetskraven
  • Revisionsmaterial för studenter för att förbereda sig inför prov

Stödmaterial för andra viktiga praktiska övningar i A-nivå specifikationer finns på A-nivå set praktikens huvudsida.


Differentiella färgningstekniker

Inom mikrobiologin används differentiella färgningstekniker oftare än enkla fläckar som ett sätt att samla information om bakterier. Differentiella färgningsmetoder, som vanligtvis kräver mer än en färgning och flera steg, hänvisas till som sådana eftersom de tillåter differentiering av celltyper eller cellstrukturer. Den viktigaste av dessa är Gram-färgningen. Andra differentiella färgningsmetoder inkluderar endosporfärgningen (för att identifiera endosporbildande bakterier), den syrafasta färgningen (för att särskilja Mycobacterium arter från andra bakterier), en metakromatisk färgning för att identifiera fosfatlagringsgranuler och kapselfärgningen (för att identifiera inkapslade bakterier). Vi kommer att utföra Gram-färgnings- och endospore-färgningsprocedurerna i labbet och se förberedda diabilder som framhäver några av de andra cellulära strukturerna som finns i vissa bakterier.


Smörjberedning:

  1. Ta ett fettfritt torrglas.
  2. Sterilisera inokuleringsöglan på en låga från en bunsenbrännare.
  3. Överför en ögla med kultur (eller provet) med steril slinga och gör ett utstryk i mitten. Utstryk bör inte vara mycket tunt eller mycket tjockt.
  4. Låt köttet torka i luften.
  5. Fixera det torra utstryket genom att föra objektglaset 3-4 gånger genom lågan snabbt med utsmetningssidan uppåt.

Gramfärgning:

  1. Placera objektglasen på färgningsstavarna.
  2. Täck smeten med kristallviolett fläck och låt stå i 1 minut.
  3. Tvätta noggrant under rinnande kranvatten.
  4. Fyll utsmeten med Gram's jodlösning och låt stå i 1 minut.
  5. Töm av jodet. Tvätta objektglaset för igen i en mjuk ström av kranvatten.
  6. Fyll objektglaset med avfärgningsmedlet och vänta sedan i 20-30 sekunder. Detta kan också göras genom att lägga till en droppe för droppe till objektglaset tills avfärgningsmedlet som rinner från objektglasen rinner klart.
  7. Tvätta försiktigt objektglaset under rinnande kranvatten och rinna av helt.
  8. Motfärga med safranin för och och vänta i cirka 30 sekunder till 1 minut.
  9. Tvätta objektglaset i en mild och indirekt ström av kranvatten tills ingen färg syns i avloppsvattnet och torka sedan av med absorberande papper.
  10. Observera under mikroskop.

Hur man undervisar i biologi

Den här artikeln var medförfattare av Soren Rosier, PhD. Sören Rosier är doktorand vid Stanfords Graduate School of Education. Han studerar hur barn lär varandra och hur man utbildar effektiva kamratlärare. Innan han började sin doktorsexamen var han mellanstadielärare i Oakland, Kalifornien, och forskare vid SRI International. Han tog sin grundexamen från Harvard University 2010.

Det finns 18 referenser som citeras i denna artikel, som finns längst ner på sidan.

wikiHow markerar en artikel som läsargodkänd när den får tillräckligt med positiv feedback. I det här fallet tyckte 94 % av läsarna som röstade att artikeln var användbar, vilket gav den vår status som läsare godkänd.

Den här artikeln har visats 70 779 gånger.

Biologi är en av de centrala grenarna av vetenskaplig kunskap och är relevant för ämnen inklusive medicin, genetik, zoologi, ekologi och offentlig politik. Som sådan har det potential att intressera nästan alla studenter. För att bli framgångsrik i att undervisa i biologi måste du dock tänka noga på hur du kan dela detta spännande område på ett sätt som är relaterbart och roligt. Längs vägen bör du göra det till ditt mål att eleverna ska uppnå åtminstone en grundläggande kunskap om biologiska begrepp.


Elektroniskt tilläggsmaterial finns tillgängligt online på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.4614731.

Publicerad av Royal Society under villkoren i Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/, som tillåter obegränsad användning, förutsatt att den ursprungliga författaren och källan krediteras.

Referenser

Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Kreiger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J.

2004 Molekylär cellbiologi , 5:e uppl. New York, NY: W.H. Freeman Company. Google Scholar

Mathews CK, Van Holde KE, Ahern KG

. 2000 Biokemi , 3:e uppl. Reading, MA: Addison-Wesley Publishing Company. Google Scholar

Mach H, Middaugh CR, Lewis RV

. 1992 Statistisk bestämning av medelvärdena av extinktionskoefficienterna för tryptofan och tyrosin i naturliga proteiner. Anal. Biochem. 20074-80. (doi:10.1016/0003-2697(92)90279-G) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2006 Spektrofotometrisk och kolorimetrisk bestämning av proteinkoncentration . Curr. Protokoll Mol. Biol. Kapitel 10, Enhet 10 11A. (doi:10.1002/0471142727.mb1001as76) Google Scholar

. 2007 En proteinkänslig kromofor baserad på squaraine och dess tillämpning för visuell proteindetektion på en gel för SDS-PAGE. Angew Chem. Int. Redigera. 464097-4099. (doi:10.1002/anie.200700245) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Wang F, Wen J, Huang L, Huang J, Ouyang J

. 2012 En mycket känslig "switch-on" fluorescerande sond för proteinkvantifiering och visualisering baserad på aggregationsinducerad emission Chem. Commun. 487395-7397. (doi:10.1039/c2cc33172a) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2005 Design och syntes av intramolekylära laddningsöverföringsbaserade fluorescerande reagenser för högkänslig detektion av proteiner. J. Am. Chem. Soc. 127, 17 799-17 802. (doi:10.1021/ja054739q) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Zhu H, Fan JL, Du JJ, Peng XJ

. 2016 Fluorescerande prober för avkänning och avbildning inom specifika cellulära organeller. Accounts Chem. Res. 492115-2126. (doi:10.1021/acs.accounts.6b00292) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Specht EA, Braselmann E, Palmer AE

. 2017 En kritisk och jämförande granskning av fluorescerande verktyg för avbildning av levande celler. Annu. Rev. Physiol. 7993-117. (doi:10.1146/annurev-physiol-022516-034055) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Hormeno S, Ibarra B, Chichon FJ, Habermann K, Lange BM, Valpuesta JM, Carrascosa JL, Arias-Gonzalez JR

. 2009 En centrosommanipulation avslöjar dess elektriska laddning och tillhörande dynamiska struktur. Biophys. J. 971022-1030. (doi:10.1016/j.bpj.2009.06.004) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2002 Levande cellavbildning: metoder för att studera proteindynamik i levande celler. Cellstruktur. Funktion. 27333-334. (doi:10.1247/csf.27.333) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2018 Reaktionsbaserade BODIPY-sonder för selektiv bioavbildning. Koordinering. Chem. Varv. 354121-134. (doi:10.1016/j.ccr.2017.06.021) Crossref, ISI, Google Scholar

. 2010 Tillämpning av sonder i levande cellavbildning . J. Epitel. Biol. Pharmacol. 3, 9. (doi:10.2174/1875044301003010040) Crossref, Google Scholar

Dufour P, Dufour S, Castonguay A, McCarthy N, De Koninck Y

. 2006 Två-foton laserskanning fluorescensmikroskopi för funktionell cellulär avbildning: fördelar och utmaningar eller en foton är bra ... men två är bättre! Med. Sci. 22837-844. (doi:10.1051/medsci/20062210837) Google Scholar

. 2006 Avbildning av den levande växtcellen . Plant J. 45573-598. (doi:10.1111/j.1365-313X.2006.02653.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

He MM, Han Z, Qiao J, Ngo LZ, Xiong MP, Zheng YG

. 2018 En bioortogonal fluorescerande strategi för att detektera lysinacetyltransferasaktivitet. Chem. Commun. 545594-5597. (doi:10.1039/c8cc02987c) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Niu LY, Guan YS, Chen YZ, Wu LZ, Tung CH, Yang QZ

. 2012 BODIPY-baserad ratiometrisk fluorescerande sensor för mycket selektiv detektering av glutation över cystein och homocystein. J. Am. Chem. Soc. 134, 18 928-18 931. (doi:10.1021/ja309079f) Crossref, ISI, Google Scholar

2013 Ultrakänsliga fluorescerande proteiner för avbildning av neuronal aktivitet. Natur 499295-300. (doi:10.1038/nature12354) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Du JJ, Gu QY, Chen JY, Fan JL, Peng XJ

. 2018 En ny fluorescerande sond för ratiometrisk igenkänning av protein baserat på intramolekylär laddningsöverföring. Sensorer aktivera. B Chem. 265204-210. (doi:10.1016/j.snb.2018.02.176) Crossref, ISI, Google Scholar

Baldridge A, Solntsev KM, Song C, Tanioka T, Kowalik J, Hardcastle K, Tolbert LM

. 2010 Hämning av vridning av en grönt fluorescerande proteinliknande kromofor genom metallkomplexbildning. Chem. Commun. 465686-5688. (doi:10.1039/b927313a) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Kang DH, Gho YS, Suh MK, Kang CH

. 2002 Mycket känslig och snabb proteindetektion med Coomassie brilliant blue i natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores. Tjur. Korean Chem. Soc. 231511-1512. (doi:10.5012/bkcs.2002.23.11.1511) Crossref, ISI, Google Scholar

Choi JK, Chae HZ, Hwang SY, Choi HI, Jin LT, Yoo GS

. 2004 Snabb synlig färgning av proteiner i en- och tvådimensionella natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgeler som är kompatibla med matrisassisterad laserdesorption/joniserings-masspektrometri. Elektrofores 251136-1141. (doi:10.1002/elps.200305776) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Neuhoff V, Arold N, Taube D, Ehrhardt W

. 1988 Förbättrad färgning av proteiner i polyakrylamidgeler inklusive isoelektriskt fokuserande geler med tydlig bakgrund vid nanogramkänslighet med Coomassie brilliant blue G-250 och R-250. Elektrofores 9255-262. (doi:10.1002/elps.1150090603) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Dong WH, Wang TY, Wang F, Zhang JH

. 2011 Enkel, tidsbesparande färgning av proteiner för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores med Coomassie blue . PLoS ETT 6, e22394. (doi:10.1371/journal.pone.0022394) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Boisvert FM, van Koningsbruggen S, Navascues J, Lamond AI

. 2007 Den multifunktionella kärnan . Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8574-585. (doi:10.1038/nrm2184) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Montering och demontering av kärnan under cellcykeln . Kärna 2189-194. (doi:10.4161/nucl.2.3.16246) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 2011 Nukleolen . Cold Spring Harb. Perspektiv. Biol. 3, a000638. (doi:10.1101/cshperspect.a000638) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

Sirri V, Urcuqui-Inchima S, Roussel P, Hernandez-Verdun D

. 2008 Nucleolus: den fascinerande kärnkroppen . Histochem. Cell Biol. 12913-31. (doi:10.1007/s00418-007-0359-6) Crossref, PubMed, ISI, Google Scholar

. 1975 Officiella analysmetoder . Washington, DC: Association of Official Analytical Chemists. Google Scholar

. 2008 Handbok för Kjeldahl digestion: en nyligen genomförd genomgång av den klassiska metoden med förbättringar utvecklade av Foss . Hillerød, Danmark : Foss . Google Scholar


Cellfärgningstekniker och beredning beror på vilken typ av färgning och analys som används. En eller flera av följande procedurer kan krävas för att förbereda ett prov:

  • Permeabilisering - behandling av celler, vanligtvis med ett milt ytaktivt ämne, som löser upp cellmembran för att tillåta större färgämnesmolekyler att komma in i cellen.
  • Fixering - tjänar till att "fixera" eller bevara cell- eller vävnadsmorfologi genom beredningsprocessen. Denna process kan innefatta flera steg, men de flesta fixeringsprocedurer innebär att man lägger till ett kemiskt fixativ som skapar kemiska bindningar mellan proteiner för att öka deras styvhet. Vanliga fixativ inkluderar formaldehyd, etanol, metanol och/eller pikrinsyra.
  • Montering - innebär att prover fästs på ett objektglas för observation och analys. Celler kan antingen odlas direkt på objektglaset eller så kan lösa celler appliceras på ett objektglas med en steril teknik. Tunna sektioner (skivor) av material såsom vävnad kan också appliceras på ett objektglas för observation.
  • Färgning - applicering av färgning på ett prov för att färga celler, vävnader, komponenter eller metaboliska processer. Denna process kan innebära nedsänkning av provet (före eller efter fixering eller montering) i en färglösning och sedan sköljning och observation av provet under ett mikroskop.Vissa färgämnen kräver användning av ett betsmedel, som är en kemisk förening som reagerar med fläcken för att bilda en olöslig, färgad fällning. Den betande fläcken kommer att finnas kvar på/i provet när överflödig färglösning tvättas bort.

Cellfärgningsprotokoll för mikroskopi

Mikroskopi hänvisar till den praxis som involverar användning av ett mikroskop i syfte att observera småskaliga strukturer som inte kan ses med blotta ögat och ofta är cellfärgning nödvändig eftersom strukturer är svåra att urskilja på grund av otillräcklig kontrast.

Cellfärgning är en teknik som används i huvudsyftet att öka kontrasten genom att ändra färgen på några av de delar av strukturen som observeras och därmed möjliggöra en klarare bild. Det finns en mängd olika fläckar som kan användas i mikroskopi.

Först och främst kan färgning vara in vivo eller in vitro. Skillnaden mellan dessa är att medan in vivo-färgning hänvisar till färgning av ett biologiskt ämne medan det fortfarande lever, hänvisar in vitro-färgning till en färgningsteknik där det biologiska materialet är icke-levande.

Följande är vanliga fläckar som förklarar tekniker, förberedelser och procedurer för var och en:

Hematoxylin- och Eosinfärgning

Dessa är två fläckar som används vid undersökning av tunna skivor av biologisk vävnad. Kontrast skapas av fläckarna där Haematoxylin gör kärnorna blå medan eosin gör såväl cytoplasman som andra delar rosa eller röda.

1- Mät upp 10 gram hematoxylinkristaller 500 ml vatten (70-80 grader Celsius) och blanda för att späda ut helt

2- Mät upp 20 gram alun i en separat kolv och blanda med 500 ml varmt kranvatten (70-80 grader)

3- Blanda de två blandningarna tillsammans (1 och 2)

Medan alun är betningsmedel, förhindrar tymol svamptillväxt.

5- Blandningen förvaras sedan i en genomskinlig kolv borta från direkt solljus i en vecka. Denna är täckt med en pappershandduk som möjliggör luftcirkulation (tidig mognad). Lösningen läggs sedan i en mörk kolv och toppas tätt efter en vecka och förvaras på en mörk plats i 3 veckor. (sen mognad)

1- Mät upp 10 gram eosinkristaller och tillsätt för att blanda i 1000 ml varmt kranvatten (70-80 grader). Detta ska blandas för att spädas och förvaras i en mörk kolv. Detta kan användas direkt.

1- En rehydrerad sektion färgas i en lösning av hematoxylin i 20 till 40 minuter

2- Sektionen tvättas sedan i kranvatten i ca 3 minuter tills den blir blå,

3- Sektionen är den differentierade i 70 procent etanol som innehåller 1 procent HCL i cirka 5 sekunder för att ta bort överflödigt färgämne och låta kärnkraften komma fram,

Detta tvättas sedan i kranvatten,

5- Färga med eosin i 10 minuter,

6- Tvätta sedan i ca 1 till 5 minuter i kranvatten,

7- Uttorkning, rensa och montera på ett stativ

Haematoxylin-Eosin Stain Kaposis Sarcoma lesion - Cambridge University Press http://www.cambridge.org

Papanicolaou-färgning

Detta kallas också pap-färgning eller pap-utstryk. Det används för att undersöka cellprover som har erhållits från kroppsvätskor.

Tekniken involverar en kombination av kemikalier som inkluderar:

o Ljusgrön SF gulaktig,

ACCUMATE-differentieringslösningen är klar för användning. En ersättning för Scotts kranvatten framställs genom att blanda en del av Scotts kranvattenersättningskoncentrat med 9 delar avjoniserat vatten. Detta följs sedan av filtrering av papanicolaou-färgningssystemets reagenser före användning.

1- Fixa objektglasen i ättiksfixativ i 15 minuter,

2- Absolut alkohol i två minuter,

3-70 procent alkohol i 2 minuter,

4- på 50 procent i 2 minuter

5- Kranvatten i 2 minuter,

6- djupt i hematoxylin i 4 minuter,

7- Skölj kort i kranvatten,

8- Differentiera i sur alkohol i cirka 5 sekunder,

10- Dehydrera med absolut alkohol två gånger,

11- Färga i orange G i tio sekunder,

12- Skölj i absolut alkohol två gånger

13- Färga in E.A 50 i två minuter,

14- Fläck i absolut alkohol två gånger,

15- Klar i xylen tre gånger,

16- Montera objektglaset på xylen tre gånger,

a) Närvaro av en psammomakropp i frånvaro av atypiska celler i cervicovaginalt utstryk (Papanicolaou-färgning, 200×) b) Seröst ovariecystoadenofibrom med parietal psammomakroppar (Hematoxylin och Eosin, 100×).

Pusiol et al. CytoJournal 2008 5:7

Acid och Basic Fuchsin Fläck

Acid fuchsin är ett magenta rött syrafärgämne som till stor del används för plasmafärgning medan basiskt fuchsin är ett magenta basiskt färgämne som till stor del används för att färga kärnan.

Tekniken kallas också för syrafast färgning. De sura bakterierna har en vaxartad substans (mykolsyra) på sin cellvägg som gör dem ogenomträngliga för färgningsprocedurer.

Termen syrafasta används eftersom de motstår avfärgning med sur alkohol. Carbol fuchsin, den primära fläcken innehåller fenol, som hjälper till att solubilisera cellväggen medan värme används för att öka penetrationen av fläcken.

Om du använder alkohol för att avfärga, kommer cellerna att avfärgas förutom sura snabba. Metylenblått används som motfärgning av alla celler som avfärgats. I slutet av proceduren förblir sura snabba celler röda/rosa medan icke-syrafasta celler behåller en blå färg.

Beredning av karbolfuchsin genom att blanda två lösningar:

Lösning 1-0,2 gram basiskt fuchsin och 10 ml 95 procent etanol,

Lösning 2-5 gram fenol och 90 ml destillerat vatten,

1- Svabba samman massalarverna så att massan kan spridas över objektglaset och låt torka

2- Värmefixera genom att flamma över en brännare flera gånger,

3- Översvämning med 0,2 procent karbolfuchsin i cirka 30 sekunder,

4- Tvätta bort fläcken och lufttorka sedan/torka försiktigt före undersökning

Ett mikrofotografi av Mycobacterium smegmatis (rosa) och Micrococcus luteus (blå) 1000x förstoring. Mycobacterium smegmatis är syrafast, behåller karbolfuchsinfärgämnet och ser därför rosa ut. Micrococcus luteus är inte syrafast, förlorar karbolfuchsin vid avfärgning och motfärgas med metylenblått.

Bild från: http://inst.bact.wisc.edu

Wrights fläck

Detta är en Romanowsky-typ av metakromatisk färg som framställs genom att blanda specialbehandlat metylenblått färgämne med eosin.

Den sura delen av fläcken förenas med de grundläggande komponenterna i cellerna, såsom hemoglobin, och därför kallas de eosinofila och färgas rosa eller röda.

De sura komponenterna i cellen, såsom nukleinsyrorna, tar å andra sidan det grundläggande färgämnet och färgar blått eller lila.

PH måste kontrolleras med en buffert på 6,4 till 6,7 för att undvika dålig färgning.

o Mät upp 1,0 gram wrights fläckpulver och 400 ml metanol (metylalkohol),

o Lägg till några glaspärlor för att hjälpa till att lösa upp och tillsätt etanolen till fläcken,

o Blanda väl med intervaller tills pulvret har löst sig helt (gör detta genom att värma i 37 C vattenbad för att underlätta upplösningen),

o Märk flaskorna och märk den som brandfarlig och giftig,

o Tätt ovanpå och förvara i rumstemperatur i mörker

1- Förbered en fyllning av provet och låt torka på ett objektglas,

2- Förbered tre behållare, och fyll en med ett steg Wright's Stain och de andra två med destillerat vatten,

3- Håll fläcken tätt täckt när den inte används för att undvika avdunstning (byt alltid ut fläcken när den blir otillräcklig)

4- Byt alltid ut destillerat vatten när iriserande avskum börjar bildas på ytan, eller när det börjar bli blått,

5- Doppa objektglaset i fläcken i 15 till 20 sekunder,

6- Doppa objektglaset i destillerat vatten i den andra behållaren i 15-45 sekunder,

7- Doppa objektglaset i behållare 3 i 25 sekunder med snabba dopp,

8- Torka av baksidan av bilden,

9- Torka objektglaset i vertikalt läge, på den absorberande ytan och undvik att fläcka ut fläcken,

10- Applicera olja för att undersöka mikroskopiskt,

Dessa steg bör upprepas två gånger för utstryk av märg.

1- Förbered provet och låt lufttorka,

2- Placera objektglaset på ett galler,

3- Applicera enstegs-wright-färgen med droppflaskor,

4- Vänta i cirka 15-30 sekunder och tillsätt liknande volymer destillerat vatten,

5- Häll fläck- och vattenblandningen från objektglaset,

6- Doppa objektglaset i destillerat vatten i cirka 25 sekunder med snabba dopp,

7- Torka av baksidan av bilden,

8- Torka objektglaset i vertikalt läge på den absorberande sidan och undvik att fläcka ut fläcken,

Dessa steg bör upprepas två gånger för benmärgsprover.

Bild från: http://www.vetmed.vt.edu

Gram färgning

Detta är en av de vanligaste färgningsteknikerna.

Det används till stor del för att differentiera bakteriearter som antingen grampositiva eller gramnegativa. Detta uppnås genom de kemiska egenskaperna hos bakteriecellsväggar, där olika färger visas efter färgning.

Denna teknik är baserad på det faktum att den grampositiva cellväggen har en stark attraktion för kristallviolett efter tillsats av jod jämfört med cellväggen för gramnegativ.

Jod är betningsmedel och bildar ett komplex med kristallviolett, som lätt tvättas bort från den gramnegativa cellväggen med etylalkohol.

Cellfärgning i mikroskopi är användbart och nödvändigt för att markera de strukturella delarna av ditt prov/prov som ska observeras korrekt. Det finns andra som MicroscopeMaster kan täcka i framtiden, så bokmärk den här sidan och besök igen för att se ytterligare färgningsinformation.

Lär dig mer om cellkultur, celldelning, celldifferentiering samt vävnadskulturtyper och -tekniker. Och ta en titt på skälen till att överväga att köpa ett mikroskopfärgningssats.

Mallory F.B. A.M, M.D. S.D. Patologisk teknik. Philadelphia och London. W.B. Sunders Company. Upphovsrätt, 1938, av W.B. Sunders Company. Återtryckt juni 1942 och september 1944. Sid. 70 och 9

Johnson PL, Klein MN: Applicering av Papanicolaou-färgning på paraffinsnitt. Stain Technol 31:223, 1956

Delisle, G. och L. Tomalty. 2002. Mycobacterium tuberculosis. MicrobeLibrary, American Society for Microbiology, Washington, DC.

MicroscopeMaster.com är en deltagare i Amazon Services LLC Associates Program, ett affiliate-annonseringsprogram som är utformat för att tillhandahålla ett sätt att tjäna avgifter genom att länka till Amazon.com och anslutna webbplatser.

Materialet på denna sida är inte medicinskt råd och ska inte användas för diagnos eller behandling. Även om försiktighet har iakttagits vid förberedelserna av denna sida, kan dess riktighet inte garanteras. Vetenskaplig förståelse förändras över tid.

** Var noga med att vidta största försiktighet och försiktighet när du utför ett mikroskopexperiment. MicroscopeMaster är inte ansvarigt för dina resultat eller några personliga problem som uppstår vid utförandet av experimentet. MicroscopeMasters webbplats är endast avsedd för utbildningsändamål.


Protein-proteininteraktionsdetektion: metoder och analys

Interaktion mellan protein och protein spelar en nyckelroll för att förutsäga proteinfunktionen hos målprotein och molekylers läkemedelsförmåga. Majoriteten av gener och proteiner realiserar resulterande fenotypfunktioner som en uppsättning interaktioner. De in vitro och in vivo metoder som affinitetsrening, Y2H (jäst 2 hybrid), TAP (tandem affinitetsrening) och så vidare har sina egna begränsningar som kostnad, tid och så vidare, och de resulterande datamängderna är bullriga och har fler falska positiver att kommentera läkemedelsmolekylernas funktion. Således, in silico metoder som inkluderar sekvensbaserade tillvägagångssätt, strukturbaserade tillvägagångssätt, kromosomnärhet, genfusion, in silico 2 hybrid, fylogenetisk träd, fylogenetisk profil och genuttrycksbaserade metoder utvecklades. Belysning av proteininteraktionsnätverk bidrar också i hög grad till analysen av signaltransduktionsvägar. Den senaste utvecklingen har också lett till konstruktionen av nätverk som har alla protein-protein-interaktioner med hjälp av beräkningsmetoder för signalvägar och proteinkomplexidentifiering i specifika sjukdomar.

1. Introduktion

Protein-protein-interaktioner (PPI) hanterar ett brett spektrum av biologiska processer, inklusive cell-till-cell-interaktioner och metabolisk och utvecklingskontroll [1]. Interaktion mellan protein och protein håller på att bli ett av systembiologins huvudmål. Icke-kovalenta kontakter mellan de kvarvarande sidokedjorna är grunden för proteinveckning, proteinsammansättning och PPI [2]. Dessa kontakter inducerar en mängd olika interaktioner och associationer mellan proteinerna. Baserat på deras kontrasterande strukturella och funktionella egenskaper kan PPI klassificeras på flera sätt [3]. På basis av deras interaktionsyta kan de vara homo- eller heterooligomera enligt deras stabilitet, de kan vara obligata eller icke-obligata mätt genom deras persistens, de kan vara övergående eller permanenta [4]. En given PPI kan vara en kombination av dessa tre specifika par. De övergående interaktionerna skulle bilda signalvägar medan permanenta interaktioner kommer att bilda ett stabilt proteinkomplex.

Typiskt fungerar proteiner knappast som isolerade arter medan de utför sina funktioner in vivo [5]. Det har avslöjats att över 80% av proteinerna inte fungerar ensamma utan i komplex [6]. Den omfattande analysen av autentiserade proteiner visar att proteinerna som är involverade i samma cellulära processer upprepade gånger visar sig interagera med varandra [7]. Studiet av PPI är också viktigt för att sluta sig till proteinfunktionen i cellen. Funktionaliteten hos oidentifierade proteiner kan förutsägas på bevis för deras interaktion med ett protein, vars funktion redan är avslöjad. Den detaljerade studien av PPI har påskyndat modelleringen av funktionella vägar för att exemplifiera de molekylära mekanismerna för cellulära processer [4]. Att karakterisera interaktionerna mellan proteiner i ett givet proteom kommer att vara fenomenalt för att ta reda på cellens biokemi [4]. Resultatet av att två eller flera proteiner interagerar med ett bestämt funktionellt mål kan fastställas på flera sätt. De betydande egenskaperna hos PPI har markerats av Phizicky och Fields [8].

PPI kan (i) modifiera de kinetiska egenskaperna hos enzymer (ii) fungera som en allmän mekanism för att möjliggöra substratkanalisering (iii) konstruera ett nytt bindningsställe för små effektormolekyler (iv) inaktivera eller undertrycka ett protein (v) ändra specificiteten av ett protein för dess substrat genom interaktion med olika bindningspartners (vi) tjänar en reglerande roll i antingen uppströms eller nedströms nivå.

Att avslöja protein-proteininteraktionsinformation hjälper till att identifiera läkemedelsmål [9]. Studier har visat att proteiner med ett större antal interaktioner (hubbar) kan inkludera familjer av enzymer, transkriptionsfaktorer och intrinsiskt störda proteiner, bland annat [10, 11]. PPI involverar dock mer heterogena processer och omfattningen av deras reglering är stor. För en mer exakt förståelse av deras betydelse i cellen måste man identifiera olika interaktioner och bestämma efterdyningarna av interaktionerna [4].

Under de senaste åren har PPI-data förbättrats av experimentella metoder med garanterad hög genomströmning, såsom tvåhybridsystem, masspektrometri, fagdisplay och proteinchipteknologi [4]. Omfattande PPI-nätverk har byggts från dessa experimentella resurser. Den omfattande karaktären hos PPI-data innebär dock en utmaning för laboratorievalideringen. Beräkningsanalys av PPI-nätverk blir alltmer ett obligatoriskt verktyg för att förstå funktionerna hos outforskade proteiner. För närvarande är protein-protein-interaktion (PPI) ett av nyckelämnena för utvecklingen och framstegen för det moderna systemets biologi.

2. Klassificering av PPI-detektionsmetoder

Metoder för att detektera protein-proteininteraktioner är kategoriskt indelade i tre typer, nämligen in vitro, in vivo, och in silico metoder. I in vitro tekniker utförs ett givet förfarande i en kontrollerad miljö utanför en levande organism. De in vitro metoder för PPI-detektion är tandemaffinitetsrening, affinitetskromatografi, koimmunoprecipitation, proteinmatriser, proteinfragmentkomplementering, fagdisplay, röntgenkristallografi och NMR-spektroskopi. I in vivo tekniker utförs en given procedur på hela den levande organismen själv. De in vivo metoder för PPI-detektion är jäst två-hybrid (Y2H, Y3H) och syntetisk letalitet. In silico tekniker utförs på en dator (eller) via datorsimulering. De in silico metoder för PPI-detektion är sekvensbaserade tillvägagångssätt, strukturbaserade tillvägagångssätt, kromosomnärhet, genfusion, in silico 2 hybrid, spegelträd, fylogenetiskt träd och genuttrycksbaserade metoder. Den schematiska klassificeringen ges i tabell 1.

2.1. In vitro Tekniker för att förutsäga protein-proteininteraktioner

TAP-taggning utvecklades för att studera PPI under cellens inneboende förhållanden [12]. Gavin et al. först försökte TAP-taggningsmetoden på ett sätt med hög genomströmning för att analysera jästinteraktomen [13]. Denna metod är baserad på dubbelmärkning av proteinet av intresse på dess kromosomala locus, följt av en tvåstegsreningsprocess [14]. Proteiner som förblir associerade med målproteinet kan sedan undersökas och identifieras genom SDS-PAGE [15] följt av masspektrometrianalys [15], och därigenom identifiera PPI-samarbetspartnern för det ursprungliga proteinet av intresse. En viktig dominans av TAP-märkning är dess förmåga att identifiera en mängd olika proteinkomplex och att testa aktiviteten hos monomera eller multimera proteinkomplex som finns in vivo [14]. TAP när den används med masspektroskopi (MS) kommer att identifiera proteininteraktioner och proteinkomplex.

Fördelen med affinitetskromatografin är att den är mycket känslig, kan till och med upptäcka de svagaste interaktionerna i proteiner, och även testar alla provproteiner lika för interaktion med det kopplade proteinet i kolonnen. Men falskt positiva resultat uppstår också i kolonnen på grund av hög specificitet bland proteiner, även om de inte blir involverade i cellsystemet. Proteininteraktionsstudier kan således inte helt förlita sig på affinitetskromatografi och kräver därför andra metoder för att korskontrollera och verifiera erhållna resultat.Affinitetskromatografin kan också associeras med SDS-PAGE-teknik och masspektroskopi för att generera data med hög genomströmning.

Samimmunutfällning bekräftar interaktioner med ett helcellsextrakt där proteiner är närvarande i sin naturliga form i en komplex blandning av cellulära komponenter som kan krävas för framgångsrika interaktioner. Dessutom möjliggör användning av eukaryota celler posttranslationell modifiering som kan vara väsentlig för interaktion och som inte skulle förekomma i prokaryota expressionssystem.

Proteinmikroarrayer håller snabbt på att etableras som ett kraftfullt sätt att detektera proteiner, övervaka deras uttrycksnivåer och undersöka proteininteraktioner och -funktioner. En proteinmikroarray är en bit glas på vilken olika proteinmolekyler har fästs på olika platser på ett ordnat sätt [16]. Proteinmikroarrayer har sett enorma framsteg och intresse för tillfället och har blivit ett av de aktiva områdena som växer fram inom bioteknik. Målet bakom utveckling av proteinmikroarray är att uppnå effektiv och känslig proteinanalys med hög genomströmning, genom att utföra ett stort antal bestämningar parallellt med automatiserad process.

Proteinfragmentkomplementeringsanalys är en annan metod för proteomik för identifiering av protein-proteininteraktioner i biologiska system. Proteinfragment-komplementeringsanalyser (PCA) är en familj av analyser för att detektera protein-protein-interaktioner (PPI) som har introducerats för att tillhandahålla enkla och direkta sätt att studera PPI i alla levande celler, flercelliga organismer eller in vitro [17]. PCA kan användas för att detektera PPI mellan proteiner av vilken molekylvikt som helst och uttryckta vid deras endogena nivåer. De två valen för proteinidentifiering med hjälp av en masspektroskopi är peptidfingeravtryck och hagelgevärsproteomik [18]. För peptidfingeravtryck separeras det eluerade komplexet med användning av SDS-PAGE. Gelen är antingen Coomassie-färgad eller silverfärgad och band som är unika för testprovet och som förhoppningsvis innehåller ett enda protein skärs ut, smälts enzymatiskt och analyseras med masspektrometri. Massan av dessa peptider bestäms och matchas till en peptiddatabas för att bestämma källproteinet. Gelén ger också en grov uppskattning av proteinets molekylvikt. Eftersom endast unika band klipps ut identifieras inte bakgrundsband. Rikliga bakgrundsproteiner kan skymma målproteiner medan mindre rikliga proteiner kan falla under gränserna för detektion genom färgning. Denna metod fungerar bra med renade prover som bara innehåller en handfull proteiner. Alternativt, för hagelgevärsproteomik, smälts hela eluatet, som innehåller många proteiner. Hagelgevärsproteomik är för närvarande den mest kraftfulla strategin för att analysera sådana komplicerade blandningar.

Det finns olika implementeringar av fagdisplaymetoden såväl som olika tillämpningar [19]. Ett av de vanligaste tillvägagångssätten som används är den filamentösa fagen M13. DNA:t som kodar för proteinet av intresse ligeras in i genen som kodar för ett av virionens höljeproteiner. Normalt följs processen av beräkningsidentifiering av potentiella interagerande partners och ett jäst tvåhybridvalideringssteg, men metoden är nyfödd [20].

Röntgenkristallografi [21] är i huvudsak en form av mycket högupplöst mikroskopi, som möjliggör visualisering av proteinstrukturer på atomnivå och förbättrar förståelsen av proteinfunktion. Specifikt visar det hur proteiner interagerar med andra molekyler och konformationsförändringarna i fallet med enzymer. Med denna information kan vi också designa nya läkemedel som riktar sig mot ett visst målprotein.

På senare tid har forskarna visat intresse för analys av protein-proteininteraktion genom kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi [21]. Placeringen av bindningsgränssnittet är en avgörande aspekt i proteininteraktionsanalysen. Grunden för NMR-spektroskopin är att magnetiskt aktiva kärnor orienterade av ett starkt magnetfält absorberar elektromagnetisk strålning vid karakteristiska frekvenser som styrs av deras kemiska miljö [22, 23].

2.2. In Vivo Tekniker för att förutsäga protein-proteininteraktioner

Y2H-metoden är en in vivo metod för att detektera PPI [24]. Två proteindomäner krävs i Y2H-analysen som kommer att ha två specifika funktioner: (i) en DNA-bindande domän (DBD) som hjälper till att binda till DNA, och (ii) en aktiveringsdomän (AD) ansvarig för att aktivera transkription av DNA. Båda domänerna krävs för transkription av en reportergen [25]. Y2H-analys möjliggör direkt igenkänning av PPI mellan proteinpar. Metoden kan dock medföra ett stort antal falskt positiva interaktioner. Å andra sidan kan många verkliga interaktioner inte spåras med Y2H-analys, vilket leder till falskt negativa resultat. I en Y2H-analys måste de interagerande proteinerna vara lokaliserade till kärnan, eftersom proteiner, som är mindre sannolikt att vara närvarande i kärnan, utesluts på grund av deras oförmåga att aktivera reportergener. Proteiner, som behöver posttranslationella modifieringar för att utföra sina funktioner, är osannolikt att bete sig eller interagera normalt i ett Y2H-experiment. Dessutom, om proteinerna inte är i sin naturliga fysiologiska miljö, kanske de inte viker sig ordentligt för att interagera [26]. Under det senaste decenniet har Y2H berikats genom att designa nya jäststammar som innehåller flera reportergener och nya expressionsvektorer för att underlätta transformationen av jästceller med hybridproteiner [27]. Andra allmänt använda tekniker, såsom bioluminescensresonansenergiöverföring (BRET), fluorescensresonansenergiöverföringar (FRET) och bimolekylär fluorescenskomplementering (BiFC), kräver omfattande instrumentering. FRET använder tidskorrelerad enkelfotonräkning för att förutsäga proteininteraktioner [28].

Syntetisk dödlighet är en viktig typ av in vivo genetisk screening som försöker förstå de mekanismer som tillåter fenotypisk stabilitet trots genetisk variation, miljöförändringar och slumpmässiga händelser som mutationer. Denna metod producerar mutationer eller deletioner i två eller flera gener som är livsdugliga ensamma men orsakar dödlighet när de kombineras under vissa förhållanden [29-33]. Jämfört med de resultat som erhållits i de ovannämnda metoderna, kräver de samband som detekteras genom syntetisk letalitet inte nödvändigheten av fysisk interaktion mellan proteinerna. Därför hänvisar vi till denna typ av relationer som funktionella interaktioner.

2.3. In Silico-metoder för förutsägelse av protein-proteininteraktioner

Jäst två-hybrid (Y2H) systemet och andra in vitro och in vivo tillvägagångssätt resulterade i storskalig utveckling av användbara verktyg för detektion av protein-protein-interaktioner (PPI) mellan specificerade proteiner som kan förekomma i olika kombinationer. Men de data som genereras genom dessa metoder kanske inte är tillförlitliga på grund av att eventuella PPI:er inte är tillgängliga. För att förstå det totala sammanhanget för potentiella interaktioner är det bättre att utveckla metoder som förutsäger hela spektrumet av möjliga interaktioner mellan proteiner [4].

En mängd olika in silico metoder har utvecklats för att stödja de interaktioner som har upptäckts genom experimentella metoder. Beräkningsmetoderna för in silico förutsägelse inkluderar sekvensbaserade tillvägagångssätt, strukturbaserade tillvägagångssätt, kromosomnärhet, genfusion, in silico 2 hybrid, spegelträd, fylogenetiskt träd, genontologi och genuttrycksbaserade tillvägagångssätt. Listan över alla webbservrar för in silico metoderna anges i tabell 2.

2.3.1. Strukturbaserade förutsägelsemetoder

Tanken bakom den strukturbaserade metoden är att förutsäga protein-protein-interaktion om två proteiner har en liknande struktur. Därför, om två proteiner A och B kan interagera med varandra, så kan det finnas två andra proteiner

vars strukturer liknar de hos proteinerna A och B, då antyds det att proteiner och kan också interagera med varandra. Men de flesta proteiner kanske inte har kända strukturer. Det första steget för denna metod är att gissa proteinets struktur baserat på dess sekvens. Detta kan göras på olika sätt. PDB-databasen erbjuder användbara verktyg och informationsresurser för forskare att bygga strukturen för ett frågeprotein [34]. Genom att använda den multimeriska gängningsmetoden, Lu et al. [35] har gjort 2 865 protein-protein-interaktioner i jäst och 1 138 interaktioner har bekräftats i DIP [36].

Nyligen har Hosur et al. [37] utvecklade en ny algoritm för att härleda protein-proteininteraktioner med hjälp av strukturbaserad metod. Coev2Net-algoritmen, som är en trestegsprocess, innefattar förutsägelse av bindningsgränssnittet, utvärdering av gränssnittets kompatibilitet med en gränssnittssamevolutionsbaserad modell och utvärdering av konfidenspoängen för interaktionen [37]. Algoritmen när den tillämpas på binära proteininteraktioner har ökat algoritmens prestanda jämfört med befintliga metoder [38]. Emellertid har Zhang et al. [39] har använt tredimensionell strukturell information för att förutsäga PPI med en noggrannhet och täckning som är överlägsen förutsägelser baserade på icke-strukturella bevis.

2.3.2. Sekvensbaserade förutsägelsemetoder

Förutsägelser av PPI har utförts genom att integrera bevis för kända interaktioner med information om sekventiell homologi. Detta tillvägagångssätt bygger på konceptet att en interaktion som finns i en art kan användas för att sluta sig till interaktionen i andra arter. Emellertid har nyligen Hosur et al. [37] utvecklade en ny algoritm för att förutsäga protein-protein-interaktioner med hjälp av trådbaserad metod som tar sekvenser som input. Algoritmen, iWARP (Interface Weighted RAPtor), som förutsäger om två proteiner interagerar genom att kombinera en ny linjär programmeringsmetod för gränssnittsanpassning med en förstärkande klassificerare [37] för interaktionsförutsägelse. Guilherme Valente et al. introducerade en ny metod som heter Universal In silico Predictor of Protein-Protein Interactions (UNISPPI), baserat på primär sekvensinformation för att klassificera proteinpar som interagerande eller icke-interagerande proteiner [40]. Kärnmetoder är hybridmetoder som använder en kombination av egenskaper som proteinsekvenser, genontologier och så vidare [41]. Det finns dock två olika metoder under sekvensbaserade kriterier.

(1) Ortologbaserad tillvägagångssätt. Metoden för sekvensbaserad förutsägelse är att överföra annotering från en funktionellt definierad proteinsekvens till målsekvensen baserat på likheten. Annotering genom likhet är baserad på den homologa naturen hos frågeproteinet i de kommenterade proteindatabaserna med hjälp av parvis lokal sekvensalgoritm [42]. Flera proteiner från en organism som studeras kan dela betydande likheter med proteiner som är involverade i komplexbildning i andra organismer.

Förutsägelseprocessen börjar med jämförelsen av en sondgen eller ett protein med de annoterade proteinerna i andra arter. Om sondgenen eller -proteinet har hög likhet med sekvensen av en gen eller ett protein med känd funktion hos en annan art, antas det att sondgenen eller -proteinet har antingen samma funktion eller liknande egenskaper. De flesta subenheter av proteinkomplex var kommenterade på det sättet. När funktionen överförs från ett karakteriserat protein till ett okarakteriserat protein bör ortolog- och paralogkoncept tillämpas. Ortologer är de gener hos olika arter som har utvecklats från en gemensam förfäders gen genom artbildning. Däremot refererar paraloger vanligtvis till generna som är relaterade till duplicering inom ett genom [43]. I vid bemärkelse kommer ortologer att behålla funktionaliteten under evolutionens gång, medan paraloger kan få nya funktioner. Därför, om två proteiner - A och B - interagerar med varandra, kommer ortologerna av A och B i en ny art också sannolikt att interagera med varandra.

(2) Domänparbaserad tillvägagångssätt. En domän är en distinkt, kompakt och stabil proteinstrukturell enhet som viker sig oberoende av andra sådana enheter. Men de flesta gånger definieras domäner som distinkta regioner av proteinsekvenser som är mycket konserverade i evolutionsprocessen. Som individuella strukturella och funktionella enheter spelar proteindomäner en viktig roll i utvecklingen av förutsägelse av proteinstrukturklass, förutsägelse av subcellulär lokalisering av protein, förutsägelse av membranproteintyp och förutsägelse av enzymklass och subklass.

Konventionellt används proteindomäner för grundforskning och även för strukturbaserad läkemedelsdesign. Dessutom är domäner direkt involverade i den intermolekylära interaktionen och måste därför vara grundläggande för protein-protein-interaktion. Flera studier har visat att domän-domäninteraktioner (DDI) från olika experiment är mer konsekventa än deras motsvarande PPI [44]. Så det är ganska tillförlitligt att använda domänerna och deras interaktioner för att förutsäga protein-protein-interaktionerna och vice versa [45].

2.3.3. Kromosomnärhet/genomgivning

Med det ständigt ökande antalet fullständigt sekvenserade genomen har det globala sammanhanget av gener och proteiner i de färdiga genomen försett forskarna med den berikade information som behövs för att detektera protein-proteininteraktion. Det är välkänt att de funktionellt besläktade proteinerna tenderar att vara organiserade mycket nära i regioner på genomen i prokaryoter, såsom operoner, klustren av funktionellt besläktade gener som transkriberas som ett enda mRNA. Om grannskapsförhållandet är bevarat över flera genom, kommer det att vara mer relevant för att antyda den potentiella möjligheten för den funktionella kopplingen mellan proteinerna som kodas av de relaterade generna. Och detta bevis användes för att studera den funktionella associationen av motsvarande proteiner. Detta förhållande bekräftades av de experimentella resultaten och visade sig vara mer oberoende av relativ genorientering. Nyligen har det visat sig att det finns en funktionell koppling mellan de intilliggande dubbelriktade generna längs kromosomen [46]. Intressant nog är förhållandet mellan intilliggande dubbelriktat transkriberade gener med konserverad genorientering i de flesta fall att en gen kodar för en transkriptionell regulator och den andra tillhör icke-regulatoriskt protein [47]. Det har visat sig att de flesta av regulatorerna kontrollerar transkriptionen av den divererande försiktigt transkriberade målgenen/operonen och reglerar också automatiskt sin egen biosyntes. Detta förhållande tillhandahåller ett annat sätt att förutsäga målprocesserna och regulatoriska funktioner för transkriptionella regulatorer. En av fallgroparna med denna metod är att den är direkt lämpad för bakteriegenomet eftersom genangränsande är bevarade i bakterierna.

2.3.4. Gene Fusion

Genfusion, som ofta kallas Rosetta-stenmetoden, bygger på konceptet att några av de endomäninnehållande proteinerna i en organism kan smälta samman för att bilda ett multidomänprotein i andra organismer [48, 49]. Detta domänfusionsfenomen indikerar den funktionella associationen för de separata proteiner som sannolikt bildar ett proteinkomplex. Det har visat sig att fusionshändelser är särskilt vanliga i de proteiner som deltar i den metaboliska vägen [50, 51]. Denna metod kan användas för att förutsäga protein-proteininteraktion genom att använda information om domänarrangemang i olika genom. Den kan emellertid endast tillämpas på de proteiner i vilka domänarrangemanget existerar.

2.3.5. In Silico Two-Hybrid (I2h)

Metoden bygger på antagandet att interagerande proteiner bör genomgå samevolution för att hålla proteinfunktionen tillförlitlig. Med andra ord, om några av nyckelaminosyrorna i ett protein ändras, bör de relaterade aminosyrorna i det andra proteinet som interagerar med den muterade motpartnern också göra de obligatoriska mutationerna. Under analysfasen kommer de gemensamma genomen som innehåller dessa två proteiner att identifieras genom multipla sekvensanpassningar och en korrelationskoefficient kommer att beräknas för varje par av rester i samma protein och mellan proteinerna [52]. Följaktligen finns det tre olika uppsättningar för paren: två från intraproteinparen och en från interproteinparen. Protein-proteininteraktionen härleds baserat på skillnaden från fördelningen av korrelation mellan de interagerande partnerna och de individuella proteinerna. Eftersom I2h-analys är baserad på förutsägelsen av fysisk närhet mellan restpar av de två individuella proteinerna, indikerar resultatet från denna metod automatiskt den möjliga fysiska interaktionen mellan proteinerna.

2.3.6. Fylogenetiskt träd

En annan viktig metod för att detektera interaktion mellan proteinerna är fylogenetiska träd. Det fylogenetiska trädet ger proteinets utvecklingshistoria. Spegelträdmetoden förutsäger protein-proteininteraktioner under tron ​​att de interagerande proteinerna visar likhet i molekylärt fylogenetiskt träd på grund av samevolutionen genom interaktionen [53]. Den underliggande principen bakom metoden är att samevolutionen mellan de interagerande proteinerna kan reflekteras från graden av likhet från distansmatriserna för motsvarande fylogenetiska träd för de interagerande proteinerna [54]. Uppsättningen av organismer som är gemensamma för de två proteinerna väljs från multipelsekvensanpassningarna (MSA) och resultaten används för att konstruera motsvarande avståndsmatris för varje protein. BLAST-poängen kan också användas för att fylla matriserna. Sedan beräknas den linjära korrelationen bland dessa avståndsmatriser. Höga korrelationspoäng indikerar likheten mellan de fylogenetiska träden och därför anses proteinerna ha interaktionsförhållandet. MirrorTree-metoden används för att detektera samevolutionsförhållandet mellan proteiner och resultaten används för att sluta sig till möjligheten av deras fysiska interaktion.

2.3.7. Fylogenetisk profil

Tanken för denna metod är att de funktionellt kopplade proteinerna tenderar att samexistera under evolutionen av en organism [55]. Med andra ord, om två proteiner har en funktionell koppling i ett genom, kommer det att finnas ett starkt tryck på dem att ärvas tillsammans under evolutionsprocessen [51]. Sålunda kommer deras motsvarande ortologer i andra genom att bevaras eller tas bort. Därför kan vi detektera närvaron eller frånvaron (samförekomst) av proteiner i den fylogenetiska profilen. En fylogenetisk profil beskriver en förekomst av ett visst protein i en uppsättning av genom: om två proteiner delar samma fylogenetiska profilering indikerar detta att de två proteinerna har den funktionella kopplingen. För att konstruera den fylogenetiska profilen, en förutbestämd tröskel för BLASTP

-värde används för att detektera närvaron eller frånvaron av de homologiska proteinerna på målgenomet med källgenomen. Denna metod ger lovande resultat i detektionen av den funktionella kopplingen mellan proteinerna och tilldelar samtidigt funktionerna för att fråga proteiner. Även om den fylogenetiska profilen har visat stor potential för att bygga det funktionella kopplingsnätverket på full genomnivå, bör följande två fallgropar nämnas: den ena är att denna metod är baserad på fullständiga genomsekvenser och den andra är att den funktionella kopplingen mellan proteiner detekteras av deras fylogenetiska profilering, så det är svårt att använda metoden för de essentiella proteinerna i cellen där ingen skillnad kan detekteras från den fylogenetiska profilen. Dessutom, även om det ökande antalet i källgenomuppsättningen kan förbättra prediktionsnoggrannheten, kan det finnas en övre gräns för denna metod.

Många genomiska händelser bidrar till bruset under samevolutionen, såsom genduplicering eller möjlig förlust av genfunktioner under evolutionen, vilket kan korrumpera den fylogenetiska profilen för enstaka gener. Filogenetiska profilbaserade metoder gav tillfredsställande prestanda endast på prokaryoter men inte på eukaryoter [56].

2.3.8. Genexpression

Metoden drar fördelen av hög genomströmning detektion av hela gentranskriptionsnivån i en organism. Genuttryck betyder kvantifiering av nivån vid vilken en viss gen uttrycks i en cell, vävnad eller organism under olika experimentella förhållanden och tidsintervall. Genom att tillämpa klustringsalgoritmerna kan olika uttrycksgener grupperas tillsammans efter deras uttrycksnivåer, och det resulterande genuttrycket under olika experimentella förhållanden kan hjälpa till att uttala de funktionella förhållandena mellan de olika generna. Mycket forskning har också utförts för att undersöka sambandet mellan gensamuttryck och proteininteraktion [57]. Baserat på jästexpressionsdata och proteomdata, är det mer sannolikt att proteiner från generna som tillhör de vanliga uttrycksprofilerande klustren interagerar med varandra än proteiner från generna som tillhör olika kluster. I andra studier har det bekräftats att intilliggande gener tenderar att uttryckas både i eukaryoter och prokaryoter. Gensamexpressionskonceptet är ett indirekt sätt att sluta sig till proteininteraktionen, vilket tyder på att det kanske inte är lämpligt för korrekt detektering av proteininteraktioner. Men som ett komplementärt tillvägagångssätt kan gensamexpression användas för att validera interaktioner som genereras från andra experimentella metoder.

3. Jämförelse av metoder för interaktion mellan protein och protein

Var och en av ovanstående metoder har använts för att detektera protein-proteininteraktionen i både prokaryoter och eukaryoter. Resultaten visar att de flesta av dem passar bättre för prokaryoter än eukaryoter [14]. Den betydande ökningen av täckningen bland dessa studier under de senaste åren kan främst bero på ökningen av antalet genom som avkodas. Detta beror på att ju fler genom som används i studien, desto högre täckning kan metoderna nå. Med ackumulering av fullt sekvenserade genom förväntas informationsinnehållet i referensgenomuppsättningen öka. Följaktligen skulle förutsägelsenoggrannheten öka med fler genom som inkorporerades i studien. Det kan förutses att, med fler och fler genom tillgängliga i framtiden, kommer prediktionspotentialen att förbättras och motsvarande kombinerade metoder kommer att få högre täckning och noggrannhet. En sak som bör nämnas är att valet av den standard som används för utvärderingen av metoderna har stor inverkan på täckningen och noggrannheten. Förutom nyckelordsåterställningen Operon och Swiss-Prot som används i ovanstående studier, har KEGG använts som standard i sökverktyget för återvinning av interagerande gener (STRING)-databasen [58]. Det kan förväntas att prediktionstäckningen och noggrannheten kommer att vara olika för varje metod under olika standarder. Uppenbarligen indikerar den uppnådda högsta täckningen för genordningsmetoden baserad på operonstandarden att metoden är starkt relaterad till operon.

De senaste tekniska framstegen har möjliggjort mätningar med hög genomströmning av protein-protein-interaktioner i cellen, vilket producerar proteininteraktionsnätverk för olika arter i snabb takt. Högkapacitetsmetoder som jäst tvåhybrid, MS och fagdisplay har dock upplevt höga frekvenser av brus och falska positiva resultat. Det finns några verifieringsmetoder för att veta tillförlitligheten hos dessa interaktioner med hög genomströmning. De är Expression Profile Reliability (EPR-index), Paralogous Verification Method (PVM) [59] Protein Localization Method (PLM) [60] och Interaction Generalities Measures IG1 [61] och IG2 [62]. EPR [63] metod jämför proteininteraktion med RNA-expressionsprofiler medan PVM analyserar paraloger av interaktörer för jämförelse. IG1-måttet är baserat på idén att interagerande proteiner som inte har några ytterligare interaktioner utöver nivå-1 sannolikt är falska positiva. IG2-måttet använder topologin för interaktioner. Bayesianska metoder har också använts för beräkning av tillförlitlighet [64–66]. PLM ger de sanna positiva (TP) som interagerande proteiner, som måste lokaliseras i samma cellulära fack eller annoteras för att ha en gemensam cellulär roll. Så för att motverka dessa fel har många metoder utvecklats som ger konfidenspoäng med varje interaktion. Metoderna som tilldelar poäng till individuella interaktioner fungerar också generellt bättre än de med den uppsättning interaktioner som erhållits från ett experiment eller en databas [67].

4. Beräkningsanalys av PPI-nätverk

Ett PPI-nätverk kan beskrivas som ett heterogent nätverk av proteiner förenade genom interaktioner som kanter. Beräkningsanalysen av PPI-nätverk börjar med illustrationen av PPI-nätverksarrangemanget. Den enklaste skissen har formen av en matematisk graf bestående av noder och kanter [68]. Protein representeras som en nod i en sådan graf och proteinerna som interagerar med det fysiskt representeras som intilliggande noder förbundna med en kant. En undersökning av nätverket kan ge en mängd olika resultat. Till exempel kan angränsande proteiner i grafen förmodligen dela mer samma funktionalitet. Utöver funktionaliteten kommer tätt sammankopplade subgrafer i nätverket sannolikt att bilda proteinkomplex som en enhet i vissa biologiska processer. Således kan funktionaliteten hos ett protein härledas genom fläckar vid proteinerna som det interagerar med och proteinkomplexen till vilka det finns. Den topologiska förutsägelsen av nya interaktioner är ett nytt och användbart alternativ baserat uteslutande på den strukturella informationen som tillhandahålls av PPI-nätverkets (PPIN) topologi [69]. Vissa algoritmer som slumpmässig layoutalgoritm, cirkulär layoutalgoritm, hierarkisk layoutalgoritm och så vidare används för att visualisera nätverket för vidare analys. Exakt, beräkningsanalysen av PPI-nätverk är utmanande, med dessa stora barriärer som ofta konfronteras [4]: ​​(1) proteininteraktionerna är inte stabila (2) ett protein kan ha olika roller för att utföra (3) två proteiner med distinkta funktioner interagerar med varandra med jämna mellanrum.

5. Rollen för PPI-nätverk inom proteomik

Att förutsäga proteinfunktionaliteten är ett av huvudmålen för PPI-nätverket. Trots de senaste omfattande studierna på jäst finns det fortfarande ett antal funktionellt oklassificerade proteiner i jästdatabasen, vilket speglar det kommande behovet av att klassificera proteinerna. Den funktionella annoteringen av mänskliga proteiner kan ge en stark grund för fullständig förståelse av cellmekanismer, information som är värdefull för läkemedelsupptäckt och utveckling [4]. Den ökade tillgängligheten av PPI-nätverk har utvecklat olika beräkningsmetoder för att förutsäga proteinfunktioner. Tillgången på tillförlitlig information om proteininteraktioner och deras närvaro i fysiologiska och patofysiologiska processer är avgörande för utvecklingen av protein-protein-interaktionsbaserad terapi. Kompendiet av alla kända protein-protein-interaktioner (PPI) för en given cell eller organism kallas interaktom.

Proteinfunktioner kan förutsägas på basis av modulariseringsalgoritmer [4]. Förutsägelser som hittas på detta sätt kanske dock inte är korrekta eftersom noggrannheten i själva modulariseringsprocessen vanligtvis är låg. Det finns andra metoder som inkluderar grannräkning, Chi-kvadrat, Markov slumpmässigt fält, Prodistin och vägd-interaktionsbaserad metod för att förutsäga proteinfunktion [77]. För större noggrannhet bör proteinfunktioner förutsägas direkt från topologin eller anslutningen av PPI-nätverk [4]. Flera topologibaserade tillvägagångssätt som förutsäger proteinfunktion på basis av PPI-nätverk har introducerats. På den enklaste nivån förutsäger "grannräkningsmetoden" funktionen hos ett outforskat protein genom frekvensen av kända funktioner hos de omedelbara grannproteinerna [78]. Majoriteten av de närmaste grannarnas funktioner kan statistiskt bedömas [79]. Nyligen har antalet vanliga grannar till det kända proteinet och det okända proteinet tagits som grund för slutsatsen av funktion [80]. Den viktade grafgruvbrytningsbaserade proteinfunktionsförutsägelsen [81] är ett nytt tillvägagångssätt inom området.

Identifiering av protein-proteinkomplex är det avgörande steget för att hitta signaltransduktionsvägarna. Protein-proteinkomplex består mestadels av antikropp-antigen- och proteashämmarekomplex [82]. Kristallografi är det viktigaste verktyget för att bestämma proteinkomplex vid atomär upplösning.

Den fullständiga analysen av PPI: er kan möjliggöra bättre förståelse av cellulär organisation, processer och funktioner. De andra tillämpningarna av PPI Network inkluderar biologisk oumbärlighetsanalys [4], bedömning av läkemedelsförmågan hos molekylära mål från nätverkstopologi [4], uppskattning av interaktioners tillförlitlighet [83], identifiering av domän-domäninteraktioner [84], förutsägelse av proteininteraktioner [85], detektion av proteiner involverade i sjukdomsvägar [86], avgränsning av frekventa interaktionsnätverksmotiv [87], jämförelse mellan modellorganismer och människor [88] och proteinkomplexidentifiering [89].

6. Proteininteraktionsdatabaser

Den enorma mängden experimentella PPI-data som genereras på stadig basis har lett till konstruktionen av datorläsbara biologiska databaser för att organisera och bearbeta dessa data. Till exempel skapas databasen för biomolekylär interaktionsnätverk (BIND) på ett utbyggbart specifikationssystem som tillåter en utarbetad beskrivning av hur PPI-data härleddes experimentellt, ofta inklusive länkar direkt till de avslutande bevisen från litteraturen [75]. Databasen för interagerande proteiner (DIP) är en annan databas med experimentellt bestämda protein-protein binära interaktioner [36]. Det biologiska allmänna förvaret för interaktionsdatauppsättningar (BioGRID) är en databas som innehåller protein och genetiska interaktioner mellan tretton olika arter [70]. Interaktioner läggs regelbundet till genom en uttömmande kuration av primärlitteraturen till databaserna. Interaktionsdata extraheras från andra databaser inklusive BIND och MIPS (München Information Center for proteinsekvenser) [90], såväl som direkt från storskaliga experiment [72]. HitPredict är en resurs av högsäkerhetsprotein-proteininteraktioner från vilken vi kan få det totala antalet interaktioner i en art för ett protein och kan se alla interaktioner med konfidenspoäng [71].

Databasen Molecular Interaction (MINT) är en annan databas med experimentellt härledda PPI-data som extraherats från litteraturen, med den extra delen av att ge vikten av bevis för varje interaktion [72]. Human Protein Interaction Database (HPID) designades för att tillhandahålla humant proteininteraktionsinformation förberäknad från befintliga strukturella och experimentella data [91]. Informationen Hyperlinked over Proteins (iHOP) databas kan sökas för att identifiera tidigare rapporterade interaktioner i PubMed för ett protein av intresse [92]. IntAct [73] tillhandahåller en öppen källkodsdatabas och verktygslåda för lagring, presentation och analys av proteininteraktioner. Webbgränssnittet tillhandahåller både textuella och grafiska representationer av proteininteraktioner och gör det möjligt att utforska interaktionsnätverk i samband med GO-annoteringarna av de interagerande proteinerna. Vi har dock observerat att skärningspunkten och överlappningen mellan dessa käll-PPI-databaser är relativt liten. Nyligen har integrationen gjorts och kan utforskas i webbservern APID (Agile Protein Interaction Data Analyzer) som är ett webbverktyg för interaktiv bioinformatik utvecklat för att möjliggöra utforskning och analys av för närvarande känd information om protein-protein-interaktioner integrerade och enhetliga i en gemensam och jämförande plattform [74]. Protein Interaction Network Analysis (PINA2.0)-plattformen är en omfattande webbresurs som inkluderar en databas med enhetlig protein-protein-interaktionsdata integrerad från sex manuellt kurerade offentliga databaser och en uppsättning inbyggda verktyg för nätverkskonstruktion, filtrering, analys och visualisering [76]. Databaserna och antalet interaktioner anges i tabell 3.

7. Slutsats

Även om tillgängliga metoder inte kan förutsäga interaktioner med 100 % noggrannhet, kommer beräkningsmetoder att skala ner uppsättningen av potentiella interaktioner till en delmängd av mest sannolika interaktioner. Dessa interaktioner kommer att fungera som utgångspunkt för ytterligare laboratorieexperiment. Genuttrycksdata och proteininteraktionsdata kommer att förbättra förtroendet för protein-protein-interaktioner och motsvarande PPI-nätverk när de används kollektivt. Den senaste utvecklingen har också lett till konstruktionen av nätverk som har alla protein-protein-interaktioner med användning av beräkningsmetoder för signaltransduktionsvägar och proteinkomplexidentifiering i specifika sjukdomar.

Intressekonflikt

Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt när det gäller publiceringen av denna artikel.

Bekräftelse

Författarna vill tacka University Grants Commission (UGC) för att förlänga ekonomiskt stöd till denna studie.

Referenser

  1. P. Braun och A. C. Gingras, "Historia om protein-protein-interaktioner: från äggvita till komplexa nätverk," Proteomicsvol. 12, nr. 10, s. 1478–1498, 2012. Se på: Google Scholar
  2. Y. Ofran och B. Rost, "Analysera sex typer av protein-protein-gränssnitt," Journal of Molecular Biologyvol. 325, nr. 2, s. 377–387, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  3. I. M. A. Nooren och J. M. Thornton, "Mångfald av protein-protein-interaktioner," EMBO Journalvol. 22, nr. 14, s. 3486–3492, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  4. A. Zhang, Proteininteraktionsnätverk-beräkningsanalys, Cambridge University Press, New York, NY, USA, 2009.
  5. M. Yanagida, "Funktionell proteomik nuvarande prestationer," Journal of Chromatography Bvol. 771, nr. 1-2, s. 89–106, 2002. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  6. T. Berggård, S. Linse och P. James, "Metoder för detektion och analys av protein-protein-interaktioner," Proteomicsvol. 7, nr. 16, s. 2833–2842, 2007. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  7. C. von Mering, R. Krause, B. Snel et al., "Jämförande bedömning av storskaliga datamängder av protein-protein-interaktioner," Naturvol. 417, nr. 6887, s. 399–403, 2002. Se på: Google Scholar
  8. E.M. Phizicky och S. Fields, "Protein-proteininteraktioner: metoder för detektion och analys," Mikrobiologiska recensionervol. 59, nr. 1, s. 94–123, 1995. Se på: Google Scholar
  9. C.S. Pedamallu och J. Posfai, "Öppen källkodsverktyg för förutsägelse av genomomfattande protein-proteininteraktionsnätverk baserat på ortologinformation," Källkod för biologi och medicinvol. 5, artikel 8, 2010. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  10. A. K. Dunker, M. S. Cortese, P. Romero, L. M. Iakoucheva och V. N. Uversky, "Flexibla nät: rollerna för inre störning i proteininteraktionsnätverk." FEBS Journalvol. 272, nr. 20, s. 5129–5148, 2005. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  11. M. Sarmady, W. Dampier och A. Tozeren, "HIV-proteinsekvens hotspots för överhörning med värdnavproteiner," PLoS ETTvol. 6, nr. 8, Artikel-ID e23293, 2011. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  12. G. Rigaut, A. Shevchenko, B. Rutz, M. Wilm, M. Mann och B. Seraphin, "En generisk proteinreningsmetod för proteinkomplexkarakterisering och proteomutforskning." Naturens bioteknikvol. 17, nr. 10, s. 1030–1032, 1999. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  13. A.-C. Gavin, M. Bösche, R. Krause et al., "Funktionell organisation av jästproteomet genom systematisk analys av proteinkomplex," Naturvol. 415, nr. 6868, s. 141–147, 2002. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  14. S. Pitre, M. Alamgir, J. R. Green, M. Dumontier, F. Dehne och A. Golshani, "Beräkningsmetoder för att förutsäga protein-proteininteraktioner," Framsteg inom biokemisk teknik/bioteknikvol. 110, s. 247–267, 2008. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  15. J.S. Rohila, M. Chen, R. Cerny och M.E. Fromm, "Förbättrad tandemaffinitetsreningstagg och metoder för isolering av proteinheterokomplex från växter," Plant Journalvol. 38, nr. 1, s. S172–S181, 2004. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  16. G. MacBeath och S. L. Schreiber, "Utskrift av proteiner som mikromatriser för funktionsbestämning med hög genomströmning," Vetenskapvol. 289, nr. 5485, s. 1760–1763, 2000. Se på: Google Scholar
  17. S.W. Michnick, P.H. Ear, C. Landry, M.K. Malleshaiah och V. Messier, "Proteinfragmentkomplementeringsanalyser för storskalig analys, funktionell dissektion och dynamiska studier av protein-proteininteraktioner i levande celler." Metoder i molekylärbiologivol. 756, s. 395–425, 2011. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  18. J. J. Moresco, P. C. Carvalho och J. R. Yates III, "Identifiera komponenter av proteinkomplex i C. elegans med hjälp av samimmunoutfällning och masspektrometri," Journal of Proteomicsvol. 73, nr. 11, s. 2198–2204, 2010. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  19. G. P. Smith, "Filamentös fusionsfag: nya uttrycksvektorer som visar klonade antigener på virionytan." Vetenskapvol. 228, nr. 4705, s. 1315–1317, 1985. Se på: Google Scholar
  20. A.H.Y. Tong, B. Drees, G. Nardelli et al., "En kombinerad experimentell och beräkningsstrategi för att definiera proteininteraktionsnätverk för peptidigenkänningsmoduler," Vetenskapvol. 295, nr. 5553, s. 321–324, 2002. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  21. A.H.Y. Tong, M. Evangelista, A.B. Parsons et al., "Systematisk genetisk analys med ordnade uppsättningar av jästdeletionsmutanter," Vetenskapvol. 294, nr. 5550, s. 2364–2368, 2001. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  22. M. R. Oɼonnell, R. Gamsjaeger och J. P. Mackay, "Den strukturella analysen av protein-protein-interaktioner genom NMR-spektroskopi," Proteomicsvol. 9, nr. 23, s. 5224–5232, 2009. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  23. G. Gao, J. G. Williams och S. L. Campbell, "Protein-proteininteraktionsanalys genom kärnmagnetisk resonansspektroskopi," Metoder i molekylärbiologivol. 261, s. 79–92, 2004. Se på: Google Scholar
  24. P. Uetz, L. Glot, G. Cagney et al., "En omfattande analys av protein-protein-interaktioner i Saccharomyces cerevisiae," Naturvol. 403, nr. 6770, s. 623–627, 2000. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  25. T. Ito, T. Chiba, R. Ozawa, M. Yoshida, M. Hattori och Y. Sakaki, "En omfattande tvåhybridanalys för att utforska jästproteininteraktomen," Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americavol. 98, nr. 8, s. 4569–4574, 2001. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  26. J. I. Semple, C. M. Sanderson och R. D. Campbell, "Juryn är ute på “guilt by association” trials," Kort funktion genomisk proteomikvol. 1, nr. 1, s. 40–52, 2002. Se på: Google Scholar
  27. P. James, J. Halladay och E. A. Craig, "Genomiska bibliotek och en värdstam designad för högeffektivt tvåhybridval i jäst," Genetikvol. 144, nr. 4, s. 1425–1436, 1996. Se på: Google Scholar
  28. D. Llères, S. Swift och A. I. Lamond, "Detektera protein-protein-interaktioner in vivo med FRET med hjälp av multifotonfluorescens livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM)," Aktuella protokoll inom cytometrivol. 12, Unit12.10, 2007. Visa på: Google Scholar
  29. S. L. Rutherford, "Från genotyp till fenotyp: buffringsmekanismer och lagring av genetisk information," BioEssaysvol. 22, nr. 12, s. 1095–1105, 2000. Se på: Google Scholar
  30. J. L. Hartman IV, B. Garvik och L. Hartwell, "Cellbiologi: principer för buffring av genetisk variation." Vetenskapvol. 291, nr. 5506, s. 1001–1004, 2001. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  31. A. Bender och J.R. Pringle, "Användning av en skärm för syntetiska dödliga mutanter och multikopia-undertryckande mutanter för att identifiera två nya gener involverade i morfogenes i Saccharomyces cerevisiae," Molekylär och cellulär biologivol. 11, nr. 3, s. 1295–1305, 1991. Se på: Google Scholar
  32. S. L. Ooi, X. Pan, B. D. Peyser et al., "Global syntetisk dödlighetsanalys och funktionell profilering av jäst," Trender inom genetikvol. 22, nr. 1, s. 56–63, 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  33. J. A. Brown, G. Sherlock, C. L. Myers et al., "Global analys av genfunktion i jäst genom kvantitativ fenotypisk profilering," Molekylär systembiologivol. 2, Artikel-ID 2006.0001, 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  34. H. Berman, K. Henrick, H. Nakamura och J. L. Markley, "The Worldwide Protein Data Bank (wwPDB): att säkerställa ett enda, enhetligt arkiv av PDB-data," Nukleinsyraforskningvol. 35, nr. 1, s. D301–D303, 2007. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  35. L. Lu, H. Lu och J. Skolnick, "Multiprospector: en algoritm för förutsägelse av protein-protein-interaktioner genom multimer trådning," Proteinervol. 49, nr. 3, s. 350–364, 2002. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  36. I. Xenarios, Ł. Salwínski, X. J. Duan, P. Higney, S.-M. Kim och D. Eisenberg, "DIP, databasen för interagerande proteiner: ett forskningsverktyg för att studera cellulära nätverk av proteininteraktioner," Nukleinsyraforskningvol. 30, nej. 1, s. 303–305, 2002. Se på: Google Scholar
  37. R. Hosur, J. Xu, J. Bienkowska och B. Berger, "IWRAP: an interface threading approach with application to prediction of cancer-related protein-protein interactions," Journal of Molecular Biologyvol. 405, nr. 5, s. 1295–1310, 2011. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  38. R. Hosur, J. Peng, A. Vinayagam, U. Stelzl et al., "A computational framework for boosting confidence in high-throughput protein-protein interaction datasets," Genombiologivol. 13, nr. 8, sid. R76, 2012. Se på: Google Scholar
  39. Q.C. Zhang, D. Petrey, L. Deng et al., "Strukturbaserad förutsägelse av protein-protein-interaktioner på en genomomfattande skala," Naturvol. 490, nr. 7421, s. 556–560, 2012. Se på: Google Scholar
  40. G. T. Valente, M. L. Acencio, C. Martins och N. Lemke, "Utvecklingen av en universell i silico-prediktor för protein-protein-interaktioner," PLoS ETTvol. 8, nr. 5, artikel-ID e65587, 2013. Visa på: Google Scholar
  41. A. Ben-Hur och W.S. Noble, "Kärnmetoder för att förutsäga protein-proteininteraktioner," Bioinformatikvol. 21, nr. 1, s. i38–i46, 2005. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  42. S.-A. Lee, C.-H. Chan, C.-H. Tsai et al., "Ortholog-baserad protein-protein-interaktionsförutsägelse och dess tillämpning på inter-artsinteraktioner," BMC Bioinformatikvol. 9, bilaga 12, artikel S11, 2008. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  43. R.L. Tatusov, E.V. Koonin och D.J. Lipman, "Ett genomiskt perspektiv på proteinfamiljer," Vetenskapvol. 278, nr. 5338, s. 631–637, 1997. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  44. V. Memisevic, A. Wallqvist och J. Reifman, "Rekonstituering av proteininteraktionsnätverk med hjälp av parameterberoende domän-domäninteraktioner," BMC Bioinformatikvol. 14, s. 154–168, 2013. Se på: Google Scholar
  45. J. Wojcik och V. Sch์hter, "Protein-protein interaction map inference using interacting domain profile pars," Bioinformatikvol. 17, bilaga 1, s. S296–S305, 2001. Se på: Google Scholar
  46. M. Yamada, M. S. Kabir och R. Tsunedomi, "Divergent promotororganisation kan vara en föredragen struktur för genkontroll i Escherichia coli," Journal of Molecular Microbiology and Biotechnologyvol. 6, nr. 3-4, s. 206–210, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  47. J. Raes, J. O. Korbel, M. J. Lercher et al., "Förutsägelse av effektiv genomstorlek i meta genomiska prover," Genombiologivol. 7, s. 911–917, 2004. Se på: Google Scholar
  48. A. J. Enright, I. Illopoulos, N. C. Kyrpides och C. A. Ouzounis, "Proteininteraktionskartor för kompletta genom baserade på genfusionshändelser," Naturvol. 402, nr. 6757, s. 86–90, 1999. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  49. E. M. Marcotte, M. Pellegrini, H.-L. Ng, D.W. Rice, T. O. Yeates och D. Eisenberg, "Detektera proteinfunktion och protein-proteininteraktioner från genomsekvenser," Vetenskapvol. 285, nr. 5428, s. 751–753, 1999. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  50. R. Overbeek, M. Fonstein, M. D'Souza, G. D. Push och N. Maltsev, "Användningen av genkluster för att sluta sig till funktionell koppling." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americavol. 96, nr. 6, s. 2896–2901, 1999. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  51. C. Freiberg, "Novel computational methods in anti-microbial target identification," Drug Discovery Todayvol. 6, nr. 2, s. S72–S80, 2001. Se på: Google Scholar
  52. F. Pazos och A. Valencia, "In silico tvåhybridsystem för urval av fysiskt interagerande proteinpar," Proteinervol. 47, nr. 2, s. 219–227, 2002. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  53. T. Sato, Y. Yamanishi, M. Kanehisa, K. Horimoto och H. Toh, "Förbättring av mirrortree-metoden genom att extrahera evolutionär information", i Sekvens- och genomanalys: Metod och tillämpningar, s. 129–139, Concept Press, 2011. Se på: Google Scholar
  54. R. A. Craig och L. Liao, "Fylogenetisk trädinformation underlättar övervakad inlärning för att förutsäga protein-proteininteraktion baserat på distansmatriser," BMC Bioinformatikvol. 8, artikel 6, 2007. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  55. K. Srinivas, A. A. Rao, G. R. Sridhar och S. Gedela, "Metodologi för fylogenetisk trädkonstruktion," Journal of Proteomics & Bioinformaticsvol. 1, s. S005–S011, 2008. Se på: Google Scholar
  56. T. W. Lin, J. W. Wu och D. Tien-Hao Chang, "Kombinera fylogenetisk profileringsbaserade och maskininlärningsbaserade tekniker för att förutsäga funktionella relaterade proteiner," PLoS ETTvol. 8, nr. 9, artikel-ID e75940, 2013. Se på: Google Scholar
  57. A. Grigoriev, "Ett förhållande mellan genuttryck och proteininteraktioner på proteomskalan: analys av bakteriofagen T7 och jästen Saccharomyces cerevisiae," Nukleinsyraforskningvol. 29, nr. 17, s. 3513–3519, 2001. Se på: Google Scholar
  58. C. von Mering, L. J. Jensen, B. Snel et al., "STRING: kända och förutspådda protein-proteinassociationer, integrerade och överförda över organismer," Nukleinsyraforskningvol. 33, s. D433–D437, 2005. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  59. C. M. Deane, Ł. Salwiński, I. Xenarios och D. Eisenberg, "Protein interactions: two methods for assessment of reliability of high throughput observations," Molekylär & cellulär proteomikvol. 1, nr. 5, s. 349–356, 2002. Se på: Google Scholar
  60. E. Sprinzak, S. Sattath och H. Margalit, "Hur tillförlitliga är experimentella protein-proteininteraktionsdata?" Journal of Molecular Biologyvol. 327, nr. 5, s. 919–923, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  61. R. Saito, H. Suzuki och Y. Hayashizaki, "Konstruktion av tillförlitliga protein-protein-interaktionsnätverk med en ny interaktionsgeneralitetsmått," Bioinformatikvol. 19, nr. 6, s. 756–763, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  62. R. Saito, H. Suzuki och Y. Hayashizaki, "Interaktionsgeneralitet, en mätning för att bedöma tillförlitligheten av en protein-proteininteraktion," Nukleinsyraforskningvol. 30, nej. 5, s. 1163–1168, 2002. Se på: Google Scholar
  63. A. Mora och I. M. Donaldson, "Effekter av proteininteraktionsdataintegrering, representation och tillförlitlighet på användningen av nätverksegenskaper för förutsägelse av läkemedelsmål." BMC Bioinformatikvol. 13, sid. 294, 2012. Se på: Google Scholar
  64. A.M. Edwards, B. Kus, R. Jansen, D. Greenbaum, J. Greenblatt och M. Gerstein, "Bridging strukturell biologi och genomik: bedömning av proteininteraktionsdata med kända komplex." Trender inom genetikvol. 18, nr. 10, s. 529–536, 2002. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  65. R. Jansen, H. Yu, D. Greenbaum et al., "A bayesian networks approach for predicting protein-protein interactions from genomic data," Vetenskapvol. 302, nr. 5644, s. 449–453, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  66. S. Asthana, O. D. King, F. D. Gibbons och F. P. Roth, "Förutsäga medlemskap av proteinkomplex med hjälp av probabilistisk nätverkstillförlitlighet," Genomforskningvol. 14, nr. 6, s. 1170–1175, 2004. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  67. S. Suthram, T. Shlomi, E. Ruppin, R. Sharan och T. Ideker, "En direkt jämförelse av tilldelningsscheman för proteininteraktionsförtroende," BMC Bioinformatikvol. 7, artikel 360, 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  68. A. Wagner, "Hur den globala strukturen av proteininteraktionsnätverk utvecklas," Proceedings of the Royal Society Bvol. 270, nr. 1514, s. 457–466, 2003. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  69. C. Vittorio Cannistraci, G. Alanis-Lobato och T. Ravasi, "Minsta kurvlinjäritet för att förbättra topologisk förutsägelse av proteininteraktioner genom nätverksinbäddning," Bioinformatikvol. 29, s. i199–i209, 2013. Se på: Google Scholar
  70. C. Stark, B.-J. Breitkreutz, T. Reguly, L. Boucher, A. Breitkreutz och M. Tyers, "BioGRID: a general repository for interaction datasets," Nukleinsyraforskningvol. 34, s. D535–539, 2006. Se på: Google Scholar
  71. A. Patil, K. Nakai och H. Nakamura, "HitPredict: en databas med kvalitetsbedömda protein-proteininteraktioner i nio arter," Nukleinsyraforskningvol. 39, nr. 1, s. D744–D749, 2011. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  72. A. Chatr-aryamontri, A. Ceol, L. M. Palazzi et al., "MINT: the Molecular INTEraction database," Nukleinsyraforskningvol. 35, nr. 1, s. D572–D574, 2007. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  73. H. Hermjakob, L. Montecchi-Palazzi, C. Lewington et al., "IntAct: an open source molecular interaction databas," Nukleinsyraforskningvol. 32, s. D452–D455, 2004. Se på: Google Scholar
  74. C. Prieto och J. de Las Rivas, "APID: agile protein interaction DataAnalyzer," Nukleinsyraforskningvol. 34, s. W298–W302, 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  75. G. D. Bader, I. Donaldson, C. Wolting, B. F. F. Ouellette, T. Pawson och C. W. V. Hogue, "BIND—the biomolecular interaction network databas," Nukleinsyraforskningvol. 29, nr. 1, s. 242–245, 2001. Se på: Google Scholar
  76. M. J. Cowley, M. Pinese, K. S. Kassahn et al., “PINA v2. 0: mining interactome-moduler," Nukleinsyraforskningvol. 40, s. D862–D865, 2012. Se på: Google Scholar
  77. K.S. Ahmed och S.M. El-Metwally, "Proteinfunktionsförutsägelse baserad på protein-proteininteraktioner: en jämförande studie," IFMBE Proceedingsvol. 41, s. 1245–1249, 2014. Se på: Google Scholar
  78. B. Schwikowski, P. Uetz och S. Fields, "Ett nätverk av protein-proteininteraktioner i jäst," Naturens bioteknikvol. 18, nr. 12, s. 1257–1261, 2000. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  79. H. Hishigaki, K. Nakai, T. Ono, A. Tanigami och T. Takagi, "Bedömning av prediktionsnoggrannheten för proteinfunktion från protein-proteininteraktionsdata," Jästvol. 18, nr. 6, s. 523–531, 2001. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  80. C. Lin, D. Jiang och A. Zhang, "Förutsägelse av proteinfunktion med hjälp av vanliga grannar i protein-proteininteraktionsnätverk", i Proceedings of the 6th IEEE Symposium on BioInformatics and Bioengineering (BIBE '06), s. 251–260, oktober 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  81. T. Kim, M. Li, K. Ho Ryu och J. Shin, "Prediction of protein function from protein-protein interaction network by Weighted Graph Mining", i Proceedings of the 4th International Conference on Bioinformatics & #x26 BioMedical Technology (IPCBEE '12)vol. 29, s. 150–154, 2012. Se på: Google Scholar
  82. R. C. Liddington, "Strukturell grund för protein-protein-interaktioner," Metoder i molekylärbiologivol. 261, s. 3–14, 2004. Se på: Google Scholar
  83. J.S. Bader, A. Chaudhuri, J.M. Rothberg och J. Chant, "Att få förtroende för nätverk med hög genomströmning av proteininteraktion," Naturens bioteknikvol. 22, nr. 1, s. 78–85, 2004. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  84. K.S. Guimar฾s, R. Jothi, E. Zotenko och T.M. Przytycka, "Förutsäga domän-domäninteraktioner med ett sparsamt tillvägagångssätt," Genombiologivol. 7, nr. 11, artikel R104, 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  85. B. Lehner och A. G. Fraser, "A first-draft human protein-interaction map," Genombiologivol. 5, nr. 9, sid. R63, 2004. Se på: Google Scholar
  86. D. R. Rhodes, S. A. Tomlins, S. Varambaly et al., "Probabilistisk modell av det mänskliga protein-proteininteraktionsnätverket," Naturens bioteknikvol. 23, nr. 8, s. 951–959, 2005. Se på: Google Scholar
  87. R. Milo, S. Itzkovitz, N. Kashtan et al., "Superfamiljer av utvecklade och designade nätverk," Vetenskapvol. 303, nr. 5663, s. 1538–1542, 2004. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  88. T.K.B. Gandhi, J. Zhong, S. Mathivanan et al., "Analys av det mänskliga proteininteraktomet och jämförelse med jäst-, mask- och fluginteraktionsdatauppsättningar," Naturgenetikvol. 38, nr. 3, s. 285–293, 2006. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  89. S. Srihari och H. waileong, "Undersökning av beräkningsmetoder för förutsägelse av proteinkomplex från proteininteraktionsnätverk," Journal of Bioinformatics and Computational Biologyvol. 11, nr. 2, artikel-ID 1230002, 2013. Visa på: Google Scholar
  90. H. W. Mewes, A. Ruepp, F. Theis et al., "MIPS: curated databases and comprehensive secondary data resources in 2010," Nukleinsyraforskningvol. 39, nr. 1, s. D220–D224, 2011. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  91. K. Han, B. Park, H. Kim, J. Hong och J. Park, "HPID: den mänskliga proteininteraktionen," Bioinformatikvol. 20, nej. 15, s. 2466–2470, 2004. Visa på: Publisher Site | Google Scholar
  92. J.M. Fernández, R. Hoffmann och A. Valencia, "iHOP webbtjänster," Nukleinsyraforskningvol. 35, s. W21–W26, 2007. Visa på: Publisher Site | Google Scholar

Upphovsrätt

Copyright © 2014 V. Srinivasa Rao et al. Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras under Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, förutsatt att originalverket är korrekt citerat.


Resultat

Bakteriecellerna färgas vanligtvis enhetligt och cellens färg beror på vilken typ av färgämne som används. Om metyenblått används kan vissa granuler i det inre av cellerna hos vissa bakterier verka djupare färgade än resten av cellen, vilket beror på närvaron av olika kemiska ämnen.

Bakteriecellerna färgas vanligtvis enhetligt och cellens färg beror på vilken typ av färgämne som används. Om metylenblått används kan vissa granuler i det inre av cellerna hos vissa bakterier verka djupare färgade än resten av cellen, vilket beror på närvaron av olika kemiska ämnen.


Titta på videon: Staining technique 1st year l Staining Techniques Used in cell biology Biology best lecture (Augusti 2022).